Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie i odczynników
UWAGA: Przygotuj wszystkie próbki zgodnie z wytycznymi producenta. Podczas tej procedury należy nosić środki ochrony osobistej (fartuchy laboratoryjne, rękawice i gogle).
- Przygotować bufor do przemywania cytrynianów, łącząc 0,941 g sacharozy (11 mM stężenie końcowe), 6,4 ml 5 M chlorku sodu (NaCl, 128 mM wersja ostateczna), 5,4 ml 0,2 M fosforanu monosodowego (NaH2PO4, 4,3 mM wersja ostateczna), 9,4 ml 0,2 M fosforanu disodowego (Na2HPO4, 7,5 mM wersja ostateczna), 0,352 g cytrynianu sodu (4,8 mM wersja ostateczna), i 0,115 g kwasu cytrynowego (2,4 mM wersja ostateczna). Dostosuj całkowitą objętość do 250 ml za pomocą ddH2O. Przefiltruj przez krążek filtra 0,45 μm i dostosuj pH do 6,5. Przechowywać do 1 roku w temperaturze 4 °C. Przed użyciem doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej (RT).
- Przygotować bufor do pęknięcia, łącząc 250 mM sacharozy, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 10 mM chlorowodorku tris (hydroksymetylo)aminometanu (Tris-Cl, pH 7,4) w 100 ml objętości końcowej. Przechowywać do 1 roku w temperaturze 4 °C. Dodać 2 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy (1:1000 wersja ostateczna) i 1 μl koktajlu inhibitorów proteazy (1:2000 wersja ostateczna) do 2 ml buforu do zerwania. Trzymaj na lodzie do czasu użycia. Wyrzucić niewykorzystany bufor do zerwania z końcem.
2. Izolacja płytek krwi
- Zebrać 8-10 ml krwi ludzkiej w probówce z żółtą czapeczką zawierającą roztwór kwasu cytrynianu i dekstrozy (ACD) (75 mM cytrynian trisodowy, 124 mM dekstroza i 38 mM kwas cytrynowy, pH = 7,4; ACD: krew = 1:9). Delikatnie wymieszaj zawartość probówki 5x–6x odwracając ręcznie.
- Odwirować probówki o sile 200 x g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Zebrać osocze bogatopłytkowe (PRP) (~ 3–4 ml) do stożkowej dolnej probówki o pojemności 15 ml i pozostawić około 0,5 ml PRP z kożucha (frakcja wyglądająca na zamgloną), aby uniknąć zanieczyszczenia. Jeśli dojdzie do zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi, powtórz ten krok.
- Odwirować próbki PRP o masie 1 200 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Przemyć granulki płytek krwi (P1) przez delikatne ponowne zawieszenie w 1 ml cytrynianu, buforu do przemywania i osadu przez odwirowanie przy 1 200 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Zachowaj czysty osad płytkowy w postaci płytek krwi. Odrzucić supernatant.
- Zawiesić osady płytek krwi w 600 μl buforu do pękania zawierającego koktajle inhibitorów.
- Sonikować zawiesinę płytek krwi za pomocą sonikatora. Umieść próbkę w mini wiaderku na lód. Ustaw sonikator na ustawienie 3 na 20 s w trybie ciągłym.
UWAGA: Wyczyść sondę 10% wybielaczem, a następnie wodą destylowaną.
- Odwirować próbki poddane sonikacji przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia frakcji błoniastych. Podwielokrotne supernatanty rozmieścić w 60 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikać powtarzających się cykli rozmrażania/zamrażania płytek krwi.
3. Przygotowanie do testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej (CEI)
UWAGA: 100 μL ludzkiego lizatu płytkowego połączono od pacjentów z ALS (n = 8–10), a osoby zdrowe (n = 8–10) oddzielnie połączono i wykorzystano do optymalizacji testu.
- Wypełnij wygenerowane przez siebie szablony dla układu CEI (Tabela 1) i przygotowania próbki (Tabela 2). Tabela przygotowania mieszaniny próbek jest dynamiczna i automatycznie oblicza, ile objętości należy usunąć ze źródła.
UWAGA: Po wprowadzeniu wymaganego woluminu źródłowego do tabeli dynamicznej 2 automatycznie zostanie obliczone 0,1 X objętość bufora próbki.
- Wstępnie oznacz 25 probówek PCR o pojemności 0,2 ml kapilarami #1–#25 i umieść je w stojaku do PCR. Osadzony na lodzie.
- Wstępnie wyznacznikować probówki wirówkowe o pojemności 0,6 ml: po jednej dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego i rozcieńczenia (w razie potrzeby), które należy zastosować, jednej dla buforu 0,1x próbki, jednej dla luminolu-S/nadtlenku i jednej dla każdej próbki do rozcieńczenia (jeśli jest to wymagane). Umieść je na lodzie w stojaku na tuby.
- Wyjmij bufor do próbek, bufor do mycia, jedną płytkę i wkład dostarczony do modułu separacji CEI 12–230 kDa master kit.
- Z lodówki umieszczonej w temperaturze 4 °C wyjąć bufor do rozcieńczania przeciwciał, przeciwciała pierwszorzędowe, przeciwciała drugorzędowe, luminol, nadtlenek wodoru i opakowanie wzorcowe. Umieść wszystkie odczynniki na lodzie z wyjątkiem standardowego opakowania, które pozostaje w RT.
UWAGA: Odczynniki z opakowań standardowych są liofilizowane i uszczelniane foliową osłoną. Aby zmniejszyć straty produktu, przed otwarciem należy je krótko odwirować za pomocą mini wirówki. Aby otworzyć, probówki z odczynnikiem można przekłuć końcówką pipety lub odciągnąć od rogu.
- Aby przygotować 400 mM ditiotreitol (DTT), dodaj 40 μl wody dejonizowanej do przezroczystej probówki zawierającej naziemną telewizję
cyfrową.
- Aby przygotować 40 μl fluorescencyjnej 5x mieszanki wzorcowej, dodaj 20 μl 10x buforu próbki i 20 μl przygotowanego 400 mM roztworu DTT do różowej probówki dołączonej do zestawu.
- Aby przygotować drabinkę biotynylową, dodaj 16 μl wody dejonizowanej, 2 μl 10x buforu próbki i 2 μl przygotowanego roztworu 400 mM DTT do białej probówki dołączonej do zestawu. Delikatnie wymieszaj i przenieś do probówki o pojemności 0,2 ml do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu denaturacji.
- Przygotować 0,1 l buforu do próbki, dodając 1,5 μl 10 ml buforu do próbki i 148,5 μl wody dejonizowanej do probówki mikrowirówki o pojemności 0,6 ml. Wir do wymieszania i umieszczenia na lodzie.
- Przygotuj pożądane rozcieńczenia przeciwciał. Dodać rozcieńczalnik przeciwciał w objętościach przeznaczonych dla każdej wstępnie znakowanej probówki do mikrowirówki. Jeśli objętości są identyczne, należy zastosować technikę odwróconego pipetowania; Jeśli nie, przed dozowaniem należy wstępnie wypłukać końcówkę pipety.
UWAGA: W tym teście użyto przeciwciała A-TDP-43 pan i przeciwciała a-p(S409/410-2) TDP-43. Przeciwciało anty-ERK wykorzystano do kontroli wewnętrznej, aby upewnić się, że składniki testu działają.
- Wykonaj pipetowanie wsteczne w celu rozcieńczenia przeciwciał zgodnie z poniższym opisem. Alternatywnie dodatkowe informacje można znaleźć w literaturze.
UWAGA: Pipetowanie wsteczne jest preferowane w przypadku dozowania małych sekwencyjnych objętości roztworów. Technika ta ma pewne zalety: (i) zapewnia precyzyjną objętość, (ii) eliminuje pienienie się odczynnika w otworze końcówki oraz (iii) jest idealna dla odczynników o małej objętości (<5 μl), lepkich roztworów, roztworów środków powierzchniowo czynnych i roztworów o wysokiej prężności pary.
- Umieścić odpowiednią końcówkę w pipecie i docisnąć tłok do drugiego oporu (krok 2). Zanurz końcówkę pipety na kilka milimetrów w roztworze. Powoli zwolnić tłok, aby napełnić końcówkę pipety roztworem, gdy końcówka jest nadal zanurzona. Wyjmij końcówkę z roztworu i delikatnie dotknij krawędzi zbiornika odczynnika, aby usunąć nadmiar płynu pozostający na zewnątrz końcówki.
- Dozować roztwór, dociskając tłok do pierwszego oporu (krok 1). Nie dozuj pozostałego roztworu do końcówki.
- Opróżnij pozostały roztwór z końcówki do zbiornika odczynnika, naciskając tłok do drugiego oporu (krok 2). Zwolnić tłok do pozycji gotowości do następnego etapu pipetowania.
- Dodać wymagane przeciwciało w objętościach przeznaczonych dla każdej wstępnie znakowanej probówki do mikrowirówki (Tabela 1). Nie płukać końcówki pipety: dodać ją bezpośrednio do rozcieńczalnika i kilkakrotnie przepłukać końcówkę w celu usunięcia przeciwciał. Umieść probówki na lodzie.
- Aby przygotować mieszaninę próbek CEI, wykonaj czynności wymienione poniżej dla probówek do PCR oznaczonych od nakrętki #2 do nasadki#25: Jest to w tej samej kolejności, co w Tabeli 1.
- Otwórz wszystkie probówki, dodaj 1,6 μl porcji fluorescencyjnego buforu do 5x próbki do każdej probówki przy użyciu techniki odwróconego pipetowania, a następnie zamknij każdą probówkę PCR po dodaniu 5x buforu, aby zminimalizować straty próbki.
- Otworzyć wszystkie probówki, dodać 0,1x bufor próbki w objętościach określonych w tabeli 2 do każdej probówki, a następnie natychmiast zamknąć. Jeśli objętości są identyczne, należy zastosować technikę pipetowania odwrotnego. Jeśli nie, należy wstępnie przepłukać końcówkę pipety przed dozowaniem 0,1x buforu do próbki.
- Otworzyć wszystkie probówki, dodać próbkę białka w objętościach określonych w tabeli 2 do każdej probówki, a następnie natychmiast zamknąć. Jeśli objętości są identyczne, należy zastosować technikę pipetowania odwrotnego. Jeśli nie, należy wstępnie przepłukać końcówkę pipety przed dozowaniem 0,1x buforu do próbki.
- Krótko odwirować wszystkie probówki PCR w wirówce stołowej (13 000 x g przez 30 s), przetrzeć probówki PCR do wymieszania, a następnie powtórzyć wirowanie.
- Przenieś wszystkie probówki PCR do termocyklera z podgrzewaną pokrywką. Denaturyzacja próbek w określonej temperaturze i czasie trwania (tj. 95 °C przez 5 minut; 70 °C przez 10 minut).
UWAGA: Temperatura i czas trwania denaturacji muszą być zoptymalizowane dla białka docelowego.
- Powtórz krok 3.12.4.
- Włóż wszystkie probówki do PCR do stojaka na probówki i umieść je na lodzie.
- Na etapie denaturacji należy przygotować roztwór wywołujący (luminol-S w stosunku 1:1: roztwór nadtlenku), a następnie dodać 200 μl luminolu-S i 200 μl nadtlenku. Ułóż na lodzie.
- Aby załadować wstępnie napełnioną płytkę CEI próbką przygotowaną powyżej, należy dozować odczynniki i próbki do płytki testowej pokazanej na układzie testu (rysunek 1). Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
UWAGA: Jeśli objętości i roztwór są identyczne, należy zastosować technikę odwróconego pipetowania. Jeśli nie, przed nalewaniem należy wstępnie przepłukać końcówkę pipety i nie wypychać pozostałej części do płytki za pomocą drugiego ogranicznika na pipecie. Moduł separacji 12–230 kDa może zawierać oznaczoną kolorami prowadnicę ładowania płyty. Umieść ten przewodnik pod płytą podczas dodawania odczynników i próbek do studzienki, co wizualnie pomaga podczas ładowania próbki. Instrukcję ładowania płyt można również pobrać ze strony internetowej firmy.
- dodać 15 μl mieszaniny luminolu: nadtlenku do każdej studzienki w rzędzie E.
UWAGA: Najlepiej przygotować ten odczynnik tuż przed użyciem i dodać go do każdej studzienki. Jeśli jest to niewygodne, mieszaninę tę można przygotować nie później niż 30 minut przed załadowaniem płyty.
- W rzędzie D, do studzienki D1, dodać 10 μl streptawidyny-HRP.
- W rzędzie D, do studzienek D2–D25, dodać 10 μl wyznaczonego przeciwciała drugorzędowego.
- W rzędzie B dodać 10 μl rozcieńczalnika przeciwciał do każdej studzienki.
- W rzędzie C, do studzienki C1, dodać 10 μl rozcieńczalnika przeciwciał.
- W rzędzie C, do studzienek C2–C25, dodać 10 μl wyznaczonego przeciwciała pierwszorzędowego.
- W rzędzie A, do dołka A1, dodaj 5 μl biotynylowanej drabinki z probówki PCR #1.
- W rzędzie A, do studzienek A2–A25, dodać 3 μl próbki, probówki PCR #2–#25 do odpowiednich studzienek #2–#25.
- Dodać 500 μl buforu do przemywania do każdej wyznaczonej studzienki buforu do płukania.
- Odwirować płytkę przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
Tabela 1: Szablon ładowania płytki testowej CEI.
Tabela 2: Interaktywny szablon przygotowania mieszaniny próbek. Po wprowadzeniu stężenia białka podstawowego z nieznanych próbek, interaktywne komórki automatycznie obliczą, ile objętości należy użyć do przygotowania mieszanki próbek.
