$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie urządzenia
- Napełnij kanały wodą destylowaną za pomocą strzykawki. Upewnij się, że nie ma wycieków ani oporów przepływu. Zanurz urządzenie w kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut, aby usunąć pozostały akryl, klej lub niechciany materiał wewnątrz kanałów.
- Opróżnij wodę z kanałów urządzenia. Za pomocą strzykawki wprowadzić roztwór blokujący przygotowany z 5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w 1x soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) i uprzednio przefiltrowanej przez filtr strzykawkowy z polieterosulfonu (PES) o stężeniu 0,2 μm.
- Przygotować zawiesinę mikrocząstek żelaza o średnicy 7,5 μm w 5% BSA.
nuta: Mikrocząstki są wcześniej funkcjonalizowane warstwą glikolu krzemionkowo-polietylenowego (PEG), która nadaje odporność na wchłanianie białek.
- Inkubować chip i zawiesinę mikrocząstek z roztworem blokującym przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jeśli to możliwe, pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
2. Powstawanie pułapek mikrocząstek
- Włóż mikrocząsteczki do chipa za pomocą igły strzykawkowej przez wąż odpływowy kanału bocznego. Umieść chip pionowo i pozwól mikrocząsteczkom przepływać pod wpływem grawitacji przez boczny kanał. Obróć chip o 180° w dwóch krokach po 90° i pozwól, aby mikrocząstki skierowały się i zagęściły przy ograniczeniu 5 μm.
- Usuń nadmiar mikrocząstek grawitacyjnie obracając się o 45° w kierunku kanału bocznego.
- Trzymaj urządzenie w pozycji pionowej, aby uniknąć rozkręcenia pułapki na mikrocząsteczki. Rysunek 1B przedstawia podsumowanie procesu tworzenia pułapek mikrocząstek.
3. Test immunologiczny
- Przygotowanie nanocząstek
- Pobrać 2 μl zawiesiny nanocząstek o długości 100 nm uprzednio sprzężonych z lizozymem (model antygenowy). Dodać go do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej ze 100 μl roztworu blokującego. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Dodać 150 μl buforu do płukania (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Umieść probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml w separatorze magnetycznym. Przechowywać przez 15 minut, aby umożliwić oddzielenie nanocząstek (rysunek 2).
nuta: Minimalna objętość separatora magnetycznego wynosi 200 μl. Unikaj używania mniejszej objętości.
- Usunąć płyn z probówki za pomocą mikropipety. Unikaj kontaktu ze ścianką rurki, w której uformowała się osadka nanocząstek.
- Dodać 250 μl świeżego buforu do płukania. Trzymaj probówkę w mieszadle przez 15 minut.
- Powtórz kroki 3.1.3.-3.1.5. jeszcze 2x, potrząsając tylko przez 5 minut.
- Dodać żądane stężenie pierwszorzędowego przeciwciała antylizozymowego (patrz tabela materiałów). Dostosować do końcowej objętości 100 μl w rozcieńczalniku przeciwciał (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Wytrząsać przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Powtórzyć kroki prania 3.1.2.-3.1.6.
- Dodać 100 μl rozcieńczalnika przeciwciał. Dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP-AbII) (patrz tabela materiałów) w rozcieńczeniu 1:500.
- Powtórzyć kroki prania 3.1.2.-3.1.6.
- Przechowywać nanocząstki w końcowej objętości 50 μl rozcieńczalnika przeciwciał.
4. Eksperymentalny montaż
- Napełnij dwie szklane strzykawki o pojemności 100 μl wodą, podłącz wąż o długości 6,5 cm do każdej strzykawki, włóż metalowy kołek do końca węża i umieść obie strzykawki na sterowanej komputerowo pompie strzykawkowej.
- Uszczelnij wszystkie węże urządzenia akrylowego ciepłem.
- Przetnij wąż dopływowy i zachowaj tylko kilka milimetrów. Napełnij igłę dozującą buforem do płukania i włóż ją do odciętego węża. Poczekaj, aż roztwór kapie przed podłączeniem igły do urządzenia, aby zapobiec dostępowi powietrza do urządzenia.
- Odetnij wąż odpływowy od kanału bocznego. Podłączyć do pompy strzykawkowej. Następnie wykonaj tę samą procedurę dla węża wylotowego kanału głównego.
nuta: Kluczowe jest wykonanie kroków 4.3.-4.4. w tej kolejności, aby uniknąć rozpakowania pułapki na mikrocząsteczki. Jeśli to możliwe, sprawdź stan pułapki podczas tych kroków za pomocą szkła powiększającego.
- Umieść szklane szkiełko na stoliku mikroskopu. Przymocuj magnes do szkiełka za pomocą taśmy dwustronnej i umieść mały kawałek taśmy z każdej strony, aby przymocować krawędzie chipa do szkła.
- Ustawić natężenie przepływu na 50 μl/h za pomocą zakładek Natężenie przepływu i Jednostki w sterowniku pompy strzykawkowej. Wybierz tryb wycofywania i kliknij przycisk Start, aby aktywować przepływ bufora myjącego.
- Ostrożnie zbliż urządzenie do zjeżdżalni z magnesem w poziomie, tak aby obszar chipa zawierający pułapkę stykał się z magnesem.
- Przyklej krawędzie urządzenia do szyby taśmą dwustronną, aby zapobiec przesuwaniu się. Unikaj zasłaniania ścieżki optycznej do mikroskopii (rysunek 1C).
5. Immunodetekcja
- Utrzymuj przepływ buforu płuczącego przez 10 minut w temperaturze 50 μl/h w celu usunięcia nadmiaru BSA.
- Usunąć pozostały bufor do przemywania z igły dozującej za pomocą mikropipety. Dodać 50 μl zawiesiny nanocząstek.
- Zawiesinę nanocząstek należy przepływać przez 7 minut z natężeniem przepływu 100 μl/h. Następnie zmień natężenie przepływu na 50 μl/h i płyn przez kolejne 15 minut.
- Wymień igłę dozującą. Płyn buforu płuczącego przez 10 minut z prędkością 50 μl/h. Na etapie prania należy przygotować podłoże fluorogeniczne zgodnie ze specyfikacją producenta.
- Usunąć pozostały bufor do przemywania z igły dozującej za pomocą mikropipety. Dodać 100 μl substratu fluorogenicznego (patrz tabela materiałów). Przepływać przez podłoże fluorogeniczne przez 6 minut z prędkością 50 μl/h.
- Ustaw parametry pomiaru natężenia przepływu (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h i 10 μL/h) oraz czasu (6 min) w odpowiednich zakładkach Natężenie przepływu i Ustaw Timer w interfejsie sterującym pompą strzykawkową. Pamiętaj, aby wybrać tryb wycofywania dla każdego z pomiarów, które mają zostać wykonane.
- Ustaw dodatkową zakładkę Natężenie przepływu na 50 μl/h i ustaw timer na 3 min dla kroku prania.
- Włącz fluorescencję mikroskopu 15 s przed zatrzymaniem podłoża przy 50 μl/h. Rozpocznij rejestrowanie obrazu za pomocą oprogramowania kamery mikroskopowej na 10 s przed zatrzymaniem podłoża przy czasie naświetlania 1,000 milisekund. Wykonuj obrazowanie przez 6 minut przy 1 klatce/s (FPS).
- Kliknij przycisk Start dla żądanego parametru przepływu natychmiast po zatrzymaniu natężenia przepływu płukania podłoża przy 50 μL/h. Kliknij przycisk Start przepływu mycia (50 μL/h) natychmiast po zatrzymaniu wybranego przepływu pomiarowego.
- Zatrzymaj przechwytywanie obrazu i wyłącz fluorescencję mikroskopu, aby uniknąć fotowybielania podłoża.
- Powtórz kroki 5.8.-5.10. dla każdego zastosowanego natężenia przepływu pomiaru.
