UWAGA: Linia komórkowa raka jajnika, OVCAR3, została użyta w tych krokach, ale ten protokół ma szerokie zastosowanie do wielu innych linii komórkowych, w tym tych pochodzących ze źródeł innych niż jajnikowe. Schemat protokołu pokazano na rysunku 1.
1. Powlekanie komórek
- Wykonaj szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną.
- Dodać autoklawizowane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z roztworem poli-L-lizyny i umieścić na kołysce na 15 minut.
- Odessać roztwór do kaptura do hodowli tkankowej. Umyj szkiełka nakrywkowe, dodając sterylną wodę i umieść probówkę zawierającą szkiełka nakrywkowe z powrotem na bujaku na 5 minut. Powtórz ten krok prania trzy razy.
- Rozprowadź powlekane szkiełka nakrywkowe na sterylnym naczyniu i odessaj pozostałą wodę. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych przez 1 godzinę lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne kropelki wody. Po wyschnięciu zamknij naczynie parafilmem i umieść w temperaturze 4 °C.
- Umieścić jedno szkiełko nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Stosowanie szkiełek nakrywkowych z polilizyny ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia odklejaniu się komórek od szkiełek nakrywkowych na etapie przed ekstrakcją.
- Trypsynizuj komórki OVCAR3, gdy osiągną 70%-80% konfluencji.
- Aby wytrypsynizować 10-centymetrową naczynie hodowlane, które zlewa się w 70%-80%, odessać pożywkę z płytki i przemyć 5-7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Odessać PBS, dodać 1 ml 0,25% trypsyny i umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 8-10 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od dna płytki.
- Zebrać komórki z 5-10 ml pożywki i dodać do stożkowej probówki.
- Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru, stosując standardowe procedury.
- Rozcieńczyć 25 000 komórek/ml i dodać 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych z poli-L-lizyny umieszczonych w dołkach płytek 24-dołkowych. Dla każdej innej linii komórkowej określ liczbę tak, aby komórki zlewały się w około 70%-80% po trzech podwojeniach populacji.
- Hoduj komórki w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach.
2. Pulsujące komórki z IdU
- Aby komórki prawidłowo rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych, wystarczy jedno podwojenie populacji. Po jednym podwojeniu populacji, pulsuj komórki 10 μM 5-jodo-2'-deoksyurydyną (IdU) (patrz Tabela materiałów na temat odtwarzania IdU) w celu dwóch kolejnych podwojeń populacji.
nuta: Próbowaliśmy różnych analogów tymidyny, w tym bromodeoksyurydyny (BrdU), 5-chloro-2′-deoksyurydyny (CIdU) i IdU. Spośród trzech analogów, IdU zapewnia najlepszy stosunek sygnału do szumu. Obrazy porównawcze komórek pulsujących trzema różnymi analogami pokazano na rysunku 2. Zalecamy stosowanie dwóch kontroli ujemnych: (i) próbki pulsacyjnej bez IdU oraz (ii) kontroli bez przeciwciał pierwotnych. Jeśli konieczne jest oszacowanie powstawania ssDNA w związku z danym leczeniem, zalecamy dodanie leku po pierwszej rundzie podwojenia IdU.
- Po pulsowaniu z IdU przez dwa podwojenia populacji, zbierz komórki do obrazowania.
- Zastąp podłoże lodowatym 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) na lodzie przez 5 minut. Ten etap wstępnej ekstrakcji pomaga uwolnić białka cytoplazmatyczne i niezwiązane z chromatyną, pozostawiając nienaruszone białka związane z chromatyną. Niektóre linie komórkowe mogą łatwo odkleić się podczas wstępnej ekstrakcji. W takim scenariuszu można użyć 0,5% buforu CSK (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM chlorku sodu (NaCl), 300 mM sacharozy, 3 mM chlorku magnezu (MgCl2), 1 mM glikolu etylenowego kwasu tetraoctowego (EGTA) i 0,5% Triton X-100).
3. Fiksacja
- Odessać PBSTx i inkubować przez 15 minut z 3% paraformaldehydem (PFA) (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej, a następnie trzy do czterech płukań 1x PBS. Stałe ogniwa można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu podjęcia dalszych kroków.
UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny i rakotwórczy. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Wykonaj wszystkie czynności z PFA w dygestoriach i odpowiednio zutylizuj materiały.
4. Przepuszczalność i blokowanie
- Po utrwaleniu należy przepuszczać komórki za pomocą 0,5% PBSTx na lodzie przez 5 minut. Użyj wystarczającej objętości, aby pokryć całe szkiełko nakrywkowe (zwykle od 500 μl do 1 ml).
- Umyj komórki trzy do czterech razy 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) w temperaturze pokojowej. Jeden ml PBST wystarcza do umycia każdej studzienki. Wykonuj pranie jeden po drugim, bez żadnych inkubacji.
- Odessać PBST i zablokować próbki za pomocą 5% albuminy surowicy bydlęcej, BSA (tabela materiałów) wykonanej w 1x PBS (bufor blokujący) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Barwienie immunologiczne przeciwciałem IdU
- Do barwienia immunologicznego przygotuj wilgotną komorę (mokry ręcznik papierowy na płaskim dnie Tupperware). Przykryj pokrywkę płytki 24-dołkowej parafilmem, umieść w wilgotnej komorze i połóż szkiełka nakrywkowe na pokrywie płytki.
- Przygotować pierwszorzędowe przeciwciało mysie anty-BrdU (tabela materiałów), rozcieńczając je w stosunku 1:200 w buforze blokującym z kroku 4.2. Wcześniej wykazano, że przeciwciało anty-BrdU wykrywa IdU.
- Dodać 60 μl rozcieńczenia przeciwciał IdU na wierzch szkiełek nakrywkowych. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Alternatywnie, należy użyć mniejszej ilości roztworu przeciwciał, jeśli szkiełka nakrywkowe zostaną odwrócone na kroplę (20-25 μl) roztworu przeciwciał o rozcieńczeniu 1:200 pipetowaną na parafilm. Zmniejsza to również prawdopodobieństwo wyschnięcia roztworu podczas inkubacji.
- Po 1 h inkubacji odessać przeciwciało pierwszorzędowe. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej i umyj je czterokrotnie 0,2% PBST.
- W przypadku przeciwciała wtórnego należy użyć tej samej wilgotnej komory, która została opisana w kroku 5.1. Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom (tabela materiałów) w buforze blokującym (1:200). Dodać 60 μl przeciwciała drugorzędowego do szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę. To przeciwciało drugorzędowe jest wrażliwe na światło.
- Odessać przeciwciało wtórne. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej i przemyj czterokrotnie 0,2% PBST.
- Oznacz szkiełka mikroskopowe i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą podłoża mocującego 4',6-dimidino-2-fenyloindol (DAPI) (tabela materiałów). Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. 24-godzinna inkubacja jest zalecana, jeśli podłoże montażowe wymaga utwardzenia lub utwardzenia.
nuta: Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przed zobrazowaniem pod mikroskopem fluorescencyjnym. Reprezentatywny obraz pokazano na rysunku 3.
