$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Wytwarzanie i przechowywanie chipów snap
- Metoda pojedynczego transferu (rysunek 1a)
- Punktowe roztwory cAb zawierające 400 μg/ml przeciwciał i 20% glicerolu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na szkiełku nitrocelulozowym (lub funkcjonalizowanym szkle) za pomocą atramentowego skanera mikromacierzy przy wilgotności względnej 60% (1,2 nl dla każdej plamki) w odstępach 800 μm od środka do środka. Upewnij się, że zjeżdżalnia jest zamocowana na pokładzie obserwatora zgodnie z jednym rogiem (tutaj użyto lewego dolnego rogu).
- Inkubować szkiełko testowe plamkowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy wilgotności względnej 60%.
- Zaciśnij uszczelkę modułu suwaka z 16 komorami na szkiełku testowym, aby podzielić ją na 16 dołków. Przepłukać szkiełko trzykrotnie, dodając 80 μl PBS zawierającego 0,1% Tween-20 (PBST) do każdego dołka i wstrząsając z prędkością 450 obr./min na wytrząsarce, za każdym razem 5 minut.
- Do każdej studzienki dodać 80 μl roztworów blokujących i wstrząsać przez 1 godzinę z prędkością 450 obr./min.
- Zdejmij uszczelkę i osusz szkiełko testowe strumieniem azotu.
- Zamocuj suwak transferowy na pokładzie obserwatora i dociśnij lewy dolny róg zjeżdżalni do lewego dolnego rogu pokładu obserwatora. Drukarka atramentowa wykrywa szereg znaczników wyrównania (roztwór mikrokulek polistyrenu) o takim samym układzie, jak w przypadku przeciwciał wychwytujących (cAb).
- Pozostaw znaczniki wyrównania do wyschnięcia. Odwróć suwak transferowy i umieść go z powrotem na pokładzie obserwatora, przymocowując go do lewego dolnego rogu.
- Przygotować roztwory do wykrywania przeciwciał (dAb) zawierające 20 μg/ml przeciwciał, 20% glicerolu i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
- Korzystając z kamery obserwatora, zrób zdjęcie znaku wyrównania. Zaimplementuj ten obraz w programie do wykrywania jako powiernik i uzyskaj system rozpoznawania obrazu skanera atramentowego, aby zidentyfikować lewy górny znak. Użyj jego współrzędnych jako pierwszego miejsca tablicy dAb. Punktowo 8 nL na kroplę w odstępach od środka do środka 800 μm.
- Metoda podwójnego transferu (rysunek 1b)
- Umieść suwak transferowy 1 na pokładzie skanera atramentowego w lewym dolnym rogu. Punktowe roztwory cAbs zawierające 400 μg/ml przeciwciał, 20% glicerolu i 1% BSA w PBS na szkiełku za pomocą skanera do mikromacierzy atramentowej o wilgotności względnej 60% (0,4 nL dla każdej plamki i średnicy ~ 200 μm). Odstęp między środkami wynosi 400 μm.
- Zatrzaśnij szkiełko transferowe szkiełkiem testowym pokrytym nitrocelulozą (lub funkcjonalizowanym szkłem) za pomocą aparatu zatrzaskowego (rysunek 2), aby przenieść kropelki cAb na szkiełko testowe.
- Obróć wszystkie sześć przycisków z boku aparatu zatrzaskowego o 90 stopni, aby pociągnąć i zablokować wszystkie tłoki w pozycji otwartej. Włóż suwak transferowy do uchwytu suwaka w jego gnieździe z zaciśniętym rogiem skierowanym w stronę stałego kołka pogo. Obróć pierwszy zestaw trzech przycisków, aby zwolnić tłoki za pomocą złotego kołka pogo i upewnij się, że suwaki są dociśnięte do kołków wyrównujących.
- Włóż szkiełko pokryte nitrocelulozą do aparatu zatrzaskowego do góry nogami, siedząc na 4 kołkach pogo. Obróć drugi zestaw trzech przycisków, aby zwolnić tłoki za pomocą srebrnego kołka i upewnij się, że suwaki są dociśnięte do kołków wyrównujących.
- Zamknij aparat zatrzaskowy, umieszczając górną powłokę na uchwycie szkiełka za pomocą słupków wyrównujących i otworów w celu precyzyjnego pozycjonowania.
- Włóż zamknięty aparat zatrzaskowy do klatki i całkowicie dociśnij klapkę zamykającą w dół, aby ustawić mikromatryce twarzą w twarz, wywierając odpowiedni nacisk. Trzymaj zamknięte przez 1 minutę.
- Oddziel slajdy. Inkubować szkiełko testowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy wilgotności względnej 60%. Umyć, zablokować i wysuszyć szkiełko testowe zgodnie z opisem w krokach 1.1.3 - 1.1.5.
- Umieść kolejny suwak transferowy na pokładzie skanera atramentowego i dociśnij do lewego dolnego rogu. Punktowe roztwory dAb zawierające 50 lub 100 μg/ml przeciwciał (patrz Tabela 1), 20% glicerolu i 1% BSA w PBS. Upewnij się, że każda plamka ma 0.8 nl, a odstęp między punktami od środka do środka wynosi 400 μm.
- Przechowywać test i szkiełko transferowe. Zamknąć zarówno szkiełka testowe, jak i transferowe w hermetycznej torbie zawierającej środek osuszający i umieścić w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
2. Multipleksowane testy immunologiczne z chipami snap
- Wyjmij szkiełko testowe z zamrażarki. Pozostaw worek szczelnie zamknięty na 30 minut, aż szkiełko osiągnie temperaturę pokojową.
- Przygotować 7-punktowe, seryjnie rozcieńczane roztwory próbek, dodając białka do PBS zawierającego 0,05% Tween-20.
nuta: W tym przypadku stosuje się 5-krotny współczynnik rozcieńczenia. Stężenia wyjściowe dla każdego białka są wymienione w tabeli 1.
- W razie potrzeby przygotować roztwory próbek. Na przykład rozcieńczyć ludzką surowicę 4 razy w buforze PBST.
- Zacisnąć 16-komorową uszczelkę na szkiełku testowym.
- Napełnij jedną kolumnę z 8 studzienkami 7 roztworami rozcieńczającymi białka i bezbiałkowym roztworem buforowym PBST przez pipetowanie. Odpipetować roztwory próbek w pozostałych 8 studzienkach na tym samym szkiełku.
UWAGA: W każdym dołku można zmieścić 80 μl roztworów. W razie potrzeby można użyć większej liczby szkiełek do pomiaru dodatkowych próbek.
- Próbki inkubować na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć szkiełko trzykrotnie PBST na wytrząsarce przy 450 obr./min, za każdym razem 5 min. Zdejmij uszczelkę i osusz szkiełko pod strumieniem gazowego azotu.
- Wyjmij szkiełko transferowe z dAbs z zamrażarki. Przechowywać worek szczelnie zamknięty przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj szkiełko w zamkniętej komorze (np. pustym pudełku z końcówkami) zawierającej 60% kulki stabilizujące wilgotność przez 20 minut w celu ponownego nawodnienia.
- Zatrzaśnij szkiełko transferowe ze szkiełkiem testowym za pomocą aparatu zatrzaskowego (rysunek 2), aby przenieść kropelki dAb. Patrz sekcja 1.2.2 w celu zapoznania się z działaniem urządzenia zatrzaskowego.
- Oddziel slajdy. Szkiełko testowe inkubować w zamkniętej komorze zawierającej 60% kulki stabilizujące wilgotność przez 1 godzinę. Zacisnąć szkiełko testowe z uszczelką 16-komorową i przepłukać szkiełko 4 razy za pomocą PBST na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min, za każdym razem po 5 minut.
- Do każdej studzienki należy pobrać pipetą 80 μl roztworów zawierających 2,5 μg/ml fluoroforu streptawidyny w PBS. Inkubować przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 450 obr./min.
- Przepłukać szkiełko 3 razy PBST i raz wodą destylowaną na wytrząsarce przy 450 obr./min. Zdejmij uszczelkę i osusz szkiełko za pomocą azotu.
3. Skanowanie slajdów i analiza danych
- Zeskanuj szkiełko testowe za pomocą fluorescencyjnego skanera mikromatrycowego przy użyciu lasera 635 nm.
- Wyodrębnij intensywność netto każdego punktu za pomocą oprogramowania analitycznego (np. analizatora array-pro).
- Obliczyć granicę wykrywalności (LOD) każdego białka za pomocą oprogramowania statystycznego i określić stężenia białka w próbkach.
nuta: LOD definiuje się jako punkt przecięcia z osią Y krzywej wzorcowej zwiększony o trzykrotność odchylenia standardowego trzech niezależnych testów.
Tabela 1. Stężenia białek i LOD w buforze z testu 50-plex. Granica oznaczalności dla CA 15-3 jest wyrażona w U/ml (*).
powiedział:
szt.
szt.
Rozdział
szt.
szt.
Rozdział
Rozdział
szt.
szt.
szt.
szt.
Rozdział
)
Rozdział
Rozdział
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
Rozdział
Rozdział
Rozdział
powiedział:
szt.
Rozdział
szt.
powiedział:
szt.
szt.
szt.
szt.
szt.
powiedział:
szt.
szt.
szt.
Rozdział
Rozdział
Rozdział
szt.
Rozdział
szt.
szt.
Rozdział
powiedział:
szt.
szt.
szt.
szt.
| Nazwa białka | Stężenie wyjściowe (ng/ml) | LOD (pg/ml) | Nazwa białka | Stężenie wyjściowe (ng/ml) | LOD (pg/ml) |
| ANG2 | 500 | 1,3 × 104 | IŁ-6b | 1 | 2.1 × 102 |
| BDNF powiedział: | 500 | 1,0 × 102 | Ił-5 | 50 | 77 |
| CA 15-3* | 1 | 4,9 × 103 | Ił-4 | 1000 | 1,5 × 104 |
| Cea | 1000 | 5,4 × 103 | IŁ-2 | 50 | 76 Rozdział 76 |
| CXCL10/IP-10 | 50 | 1,7 × 102 | Lep | 200 | 4,0 × 102 |
| Crp | 200 | Rozdział 44 | Mig | 500 | 11 × 102 |
| Eng | 1000 | 6,2 × 102 | CCL3/MIP-1α | 50 | 3.3 |
| EFG (EFG | 50 | 1,8 × 102 | CCL4/MIP-1β | 50 | 12 |
| Europejski Instrument Ekonomiczno-Wydmieńczy (U | 200 | 1,9 × 102 | Zobacz materiał MMP-3 | 500 | 1,0 × 102 |
| FAS-L | 500 | 4,5 × 102 | M-CSF (Płyn mózgowy) | 500 | 8,2 × 103 |
| Współczynnik FGF | 500 | 1,0 × 103 | Zobacz materiał MMP-9 | 200 | 3.1 × 102 |
| G-CSF (Płyn mózgowy) | 500 | 39 Rozdział 39 | CCL2/MCP-1 | 50 | 55 |
| GM-CSF (Instrument Zarządzania Mózgowo-T | 50 | 3.8 | NCAM-1 | 500 | 1,7 × 103 |
| GRO-α | 50 | 3,0 × 102 | β-NGF | 200 | 1,4 × 103 |
| HER2 | 500 | 3,5 × 103 | NT-3 | 200 | 5,8 × 102 |
| PDGF-BB | 200 | 73 Rozdział 73 | OPN (Sieć OPN) | 500 | 1,9 × 103 |
| IL-1β | 500 | 7,9 × 102 | RBP4 | 200 | 1.2 ×102 |
| Ił-1ra | 200 | 1,1 × 103 | Sparc | 1000 | 4.6 ×104 |
| IŁ-15 | 50 | 8,2 × 102 | TNF-α | 50 | 4.4 |
| IŁ-12 | 1 | Rozdział 30 | Protokół TNF-RI | 50 | 1,3 × 102 |
| IŁ-11 | 500 | 1,2 × 103 | Format TNF-RII | 50 | 12 |
| IŁ-10 | 500 | 6.1 ×102 | FAS/TNFRSF6 | 200 | 2.8 ×102 |
| IŁ-8 | 50 | 6,6 | uPA | 200 | 24 |
| IŁ-7 | Rozdział 2.5 | 26 | uPAR(CD87) | 200 | 76 Rozdział 76 |
| IŁ-6A | 1000 | Rozdział 84 | VEGF (Fundusz Energii Nożnej | 200 | 6,7 × 102 |
