Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Barwienie pierwszym przeciwciałem
- Odwoskować i ponownie uwodnić szkiełka zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie, przeznaczając 5 minut na każdy z następujących etapów: ksylen lub równoważne odczynniki 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x i woda destylowana 2x,
nuta: Szkiełka powinny pozostać wilgotne, począwszy od tego etapu nawadniania, aż do montażu w ostatnim etapie.
- W celu opcjonalnego pobrania antygenu umieścić szkiełka w 275 ml wrzącego roztworu cytrynianu sodu (10 mM, pH = 6,0) na 8 minut. Aby roztwór pozostał w stanie wrzenia, umieść szkiełka płasko na dnie pudełka z końcówkami do pipet o wymiarach 14 x 9,5 x 9 cm3 (szer. x dł. x wys.) z pokrywką i podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W przez 8 minut. Następnie wyjmij pudełko z końcówkami do pipet z kuchenki mikrofalowej, otwórz pokrywę i pozwól roztworowi ostygnąć w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 20 minut.
- Przenieść szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% polisorbatem 20/80). Myć PBST przez 5 min 3x. Jeśli nie przejdziesz od razu do następnego kroku, przechowuj szkiełka na tym etapie z PBST w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni, jeśli nie przechodzisz natychmiast do następnego kroku.
- Do przygotowania roztworu blokującego należy użyć normalnej surowicy drugorzędowego gatunku gospodarza przeciwciała jako odczynnika blokującego. Można również stosować inne komercyjne odczynniki blokujące. W przypadku stosowania normalnej surowicy zastosowanej w badaniu przedstawionym w tym badaniu, dodaj 100 μl normalnej surowicy osła do 4,9 ml PBST. Roztwór blokujący można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.
- W celu zablokowania strząśnij PBST ze szkiełek i szybko przykryj je odpowiednią ilością roztworu blokującego. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 30 minut.
- Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (500 μl na dwie szkiełka) przy użyciu roztworu blokującego, aby rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do pożądanego stężenia. Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- W przypadku dehydrogenazy 3β-hydroksysteroidowej (3βHSD) dodać 2 μl przeciwciała 3βHSD do 498 μl roztworu blokującego.
- W przypadku hydroksylazy tyrozynowej (TH) dodać 0,5 μl przeciwciała TH do 499 μl roztworu blokującego.
- W przypadku β-kateniny dodać 1 μl przeciwciała β-kateniny do 499 μl roztworu blokującego.
- W przypadku dehydrogenazy 20α-hydroksysteroidowej (20αHSD) dodać 1 μl przeciwciała 20αHSD do 499 μl roztworu blokującego.
- W przypadku cytochromu P450 2F2 (CYP2F2) dodać 2 μl przeciwciała CYP2F2 do 498 μl roztworu blokującego.
- Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym, strząsając roztwór blokujący ze szkiełek i szybko przykrywając je wystarczającą ilością roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C. Podczas inkubacji szkiełka mogą być przykryte małym kawałkiem folii parafinowej, aby zapobiec wysychaniu.
- Następnego ranka myj szkiełka PBST przez 5 minut 3x.
- Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego (500 μl na dwa szkiełka) przy użyciu roztworu blokującego w celu rozcieńczenia biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego do pożądanego stężenia (np. 1 μl przeciwciała przeciwko myszom osła lub przeciwciała przeciwko królikowi w 499 μl roztworu blokującego). Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- Inkubować z drugim przeciwciałem, strząsając PBST ze szkiełek i szybko przykrywając je wystarczającą ilością roztworu przeciwciał drugorzędowych. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze RT.
nuta: Jeśli problemem jest endogenna biotyna, należy użyć przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą zamiast biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego. Przejdź do kroku 1.14, jeśli używasz przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą w kroku 1.10.
- Myć szkiełka PBST przez 5 minut 3x.
- Przygotować roztwór streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (SA-HRP) (500 μl na dwie szkiełka), dodając 0,5 μl SA-HRP do 499 μl PBS. Końcowe stężenie wynosi 1 μg/ml.
- Inkubować z roztworem SA-HRP. Strząśnij PBST ze szkiełek i szybko przykryj szkiełka odpowiednią ilością roztworu SA-HRP. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
- Myć szkiełka PBST przez 5 minut 3x.
- Przygotować roztwór fluoroforu i tyramidu przez rozcieńczenie fluoroforu tyramidu z jego buforem rozcieńczającym zgodnie z instrukcjami producenta (np. 5 μl fluorofor-tyramidu w 496 μl buforu rozcieńczającego).
- Przeprowadzić wytwarzanie sygnału za pomocą tyramidu fluoroforowego, strząsając PBST ze szkiełek i szybko pokrywając szkiełka wystarczającą ilością roztworu fluoroforu-tyramidu. Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji można dostosować w celu uzyskania pożądanej intensywności fluorescencji. Zatrzymaj reakcję, przenosząc szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST. Myć szkiełka preparatem PBST przez 3 min 2x.
- Sygnały można szybko sprawdzić pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić wynik na tym etapie. Jeśli szkiełka nakrywkowe nie są używane, nałóż kroplę glicerolu:PBS (1:1) na każdą sekcję, aby próbki były wilgotne. Myć szkiełka preparatem PBST przez 3 min 2x. Preparaty można przechowywać w PBST w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed przejściem do następnego etapu.
2. Usuń pierwsze przeciwciało
- Umieścić szkiełka w 275 ml wrzącego roztworu cytrynianu sodu (10 mM, pH = 6,0) na co najmniej 8 minut. Utrzymuj roztwór w stanie wrzenia, umieszczając szkiełka płasko na dnie pudełka z końcówkami do pipet o wymiarach 14 x 9,5 x 9 cm3 (szer. x dł. x wys.) z pokrywką i podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej o mocy 70% w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W przez 8 minut. Jeżeli preferowany jest dłuższy czas oddzielania, może być konieczne uzupełnienie buforu wrzącym roztworem cytrynianu sodu, aby szkiełka były przez cały czas zanurzone w roztworze buforowym. Wyjmij pudełko końcówek do pipet z kuchenki mikrofalowej, otwórz pokrywę i pozwól roztworowi ostygnąć w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.
- Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST. Myć PBST przez 5 min 3x. Jeśli następny krok nie zostanie wykonany natychmiast, przechowuj szkiełka w słoiku Coplin z PBST w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni.
3. Barwienie drugim przeciwciałem
- Zacznij od kroku blokowania i postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami w kroku od 1.5 do kroku 1.14. Na etapach wytwarzania sygnału (krok 1.15 i krok 1.16) należy użyć tyramidu fluoroforowego w innym spektrum fluorescencji.
nuta: Szkiełka można kilkakrotnie zdejmować przy użyciu tej metody, aby umożliwić barwienie multipleksowe. Ostatnie przeciwciało nie wymaga fluoroforu-tyramidu jako reportera. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem może być użyte do pokazania sygnałów z ostatniego przeciwciała pierwszorzędowego.
- Inkubować szkiełka z 2 μg/ml roztworu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) lub Hoechsta przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, jeśli potrzebne jest barwienie jądrowe. Następnie umyj szkiełka PBST przez 3 minuty 2x.
