Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Streszczenie

Źródło: Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB

1. Barwienie immunofluorescencyjne in situ limfocytów naciekających nowotwór (TIL)

1. Wytyczne proceduralne
   1. Wykonaj wszystkie kroki eksperymentalne w temperaturze pokojowej.
   2. Na wszystkich etapach należy wykonać rozcieńczenia roztworem soli fizjologicznej Tris Buffer (TBS; patrz Tabela Materiałów).
   3. Wykonać płukanie w TBS dla wszystkich etapów z wyjątkiem po inkubacji przeciwciał pierwotnych. W tym ostatnim przypadku użyj Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, patrz tabela materiałów). Skład buforu i jego rozpuszczenie, patrz Tabela 1.
   4. Użyj komory wilgotnościowej do inkubacji przeciwciał i słoika do barwienia do mycia.
   5. Nie pozwól, aby sekcja wyschła podczas zabiegu.
2. Wstępnej obróbki
   1. Rozmrozić szkiełko zawierające próbkę tkanki i ostrożnie osuszyć szkiełko wokół próbki ręcznikiem papierowym. Określić obszar reakcji, w którym znajduje się tkanka, za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (patrz tabela materiałów). Suszyć przez 2 min.
   2. Utrwal próbki w 100% acetonie na 5 minut, wysusz przez 2 minuty i myj TBS przez 10 minut.
3. Nasycenie i blokada
   1. Wstępnie traktuj szkiełka przez 10 minut 3 kroplami awidyny 0,1%, dotknij i/lub przesuń szkiełko, aby rozprowadzić awidynę i usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie traktuj przez 10 minut 3 kroplami biotyny 0,01% (patrz tabela materiałów), dotknij i/lub przesuń. Umyć TBS.
   2. Wykonaj blokadę receptorów Fc. Nałożyć 100 μl 5% objętości normalnej surowicy rozcieńczonej w TBS. Użyć surowicy tego samego gatunku gospodarza, co znakowane przeciwciało drugorzędowe lub trzeciorzędowe (patrz tabela materiałów); Stosowano tu surowicę osła. Inkubować przez 30 minut.
   3. Podczas inkubacji krótko odkręć anty-CD8, białko śmierci komórki 1 (PD-1) oraz immunoglobulinę komórek T i przeciwciała zawierające białko-3 (Tim-3) (tabela materiałów). Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych w TBS zgodnie z opisem w Tabeli 2.
4. Barwienie immunologiczne dla CD8, PD-1 i Tim-3
   1. Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwotnych. Patrz Tabela materiałów i Tabela 2 dla zastosowanych przeciwciał (anty-CD8, PD-1, Tim-3 i odpowiadających im przeciwciał drugorzędowych) i ich stężeń.
   2. Dotknij i/lub strzepnij pozostałą surowicę osła (dodaną w kroku 1.3.2). Inkubować szkiełka z 100 μl nieznakowanej mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.
   3. Podczas inkubacji należy krótko odkręcić przeciwciała anty-królicze cyjaniny 5, anty-kozie Alexa Fluor 488 i biotynylowane przeciwciała mysie i przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych, jak opisano w Tabeli 2.
   4. Myć szkiełka w TBST przez 5 minut. Wysuszyć szkiełka.
   5. Inkubować szkiełka ze 100 μl przeciwciał drugorzędowych przez 30 minut w wilgotnej komorze.
   6. Przygotować mieszaninę przeciwciał trzeciorzędowych zawierających cyjaninę-3-streptawidynę, jak opisano w Tabeli 2.
   7. Myj szkiełka w TBS przez 10 minut. Wysusz szkiełka.
   8. Inkubować szkiełka ze 100 μl mieszaniny przeciwciał trzeciorzędowych przez 30 minut.
   9. Myj szkiełka w TBS przez 10 minut. Wysusz szkiełka.
5. Montaż ogniwa
   1. Zamontuj szkiełka w pożywce montażowej zawierającej 4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI) (1,5 μg/ml DAPI) z szkiełkiem nakrywkowym kompatybilnym z mikroskopią fluorescencyjną (patrz tabela materiałów).
      nuta: Jako kontrolę ujemną dla każdego eksperymentu użyto jednego szkiełka z przeciwciałami dopasowanymi do izotypu w tym samym stężeniu, co odpowiadające im przeciwciała. Do tego barwienia użyliśmy mysich przeciwciał IgG1, króliczych IgG i kozich przeciwciał kontroli ujemnej IgG (patrz tabela materiałów). Jako kontrolę pozytywną użyliśmy ludzkiego przerostu migdałków, o którym wiadomo, że jest dodatni dla badanych markerów, w każdym eksperymencie. Typowe barwienie opisano w wynikach (ryc. 1). Barwienie mono-CD8, PD-1 i Tim-3 powinno być wykonywane indywidualnie (jedno barwienie na szkiełko) z tą samą obróbką wstępną i bez DAPI. Należy również wykonać preparat w tych samych warunkach doświadczalnych bez żadnego przeciwciała, a jedynie z podłożem montażowym DAPI. Szkiełko powinno być zobrazowane w identycznych warunkach eksperymentalnych bez przeciwciał i bez DAPI.

2. Analiza fluorescencyjna i automatyczne zliczanie komórek

1. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu automatycznego
   1. Utwórz protokół.
      1. Włącz oprogramowanie mikroskopu automatycznego i oświetlacz fluorescencyjny.
      2. Na pasku menu kliknij "Plik", "Utwórz protokół", wybierz "DAPI", "FITC" i "TRITC".
      3. Kliknij "Dalej", "Sekcja tkanki" i kliknij "Dalej", "Nazwa protokołu". Wybierz nazwę, na przykład "CD8-PD-1-Tim-3", kliknij "Dalej" i "Zapisz".
      4. Ręczne umieszczanie slajdu na stole montażowym.
      5. Na pasku menu kliknij "ustawienia" i "ustawienia". Kliknij "Ustaw dom Z" w nowym oknie.
      6. Dostosuj czas ekspozycji za pomocą szkiełka kontroli pozytywnej, tj. CD8, PD-1 i Tim-3 potrójnie wybarwionych próbką DAPI.
      7. Na pasku narzędzi kliknij w "ustaw ekspozycję".
      8. Dostosuj czas ekspozycji dla każdego filtra, aż do uzyskania wystarczającego, ale nienasyconego sygnału.
      9. W przypadku obrazowania monochromatycznego wykonaj następujące czynności:
      10. Wybierz akwizycję, a następnie w sekcji "autofokus" wybierz filtr DAPI.
      11. W polu "Limit obszaru skanowania" przesuń górny róg obiektywu do lewego górnego rogu slajdu. Kliknij "Zaznacz". Zrób to samo dla prawego dolnego rogu.
          nuta: Ten krok wyznacza obszar obrazowania o niskiej mocy (obrazowania LP) przy 4X; Pamiętaj, aby dobrze umieścić znak, aby otoczyć wszystkie próbki z serii.
      12. W przypadku obrazowania o dużej mocy (HP) należy wykonać następujące czynności:
      13. W sekcji "Autofokus" wybierz "DAPI".
      14. W paśmie "Akwizycja" wybierz "DAPI", "FITC", "Cy3" i "Cy5". Kliknij "OK". Kliknij "Plik" i "Zapisz protokół" na pasku menu.
   2. Zeskanuj slajdy.
      1. Załaduj protokół, klikając "Plik" i "Załaduj protokół" na pasku menu. Kliknij "Start".
      2. Wprowadź "Lab ID" (lokalizacja folderu do przechowywania obrazu). Wprowadź identyfikator slajdu, aby zidentyfikować slajd. Kliknij "Dalej".
      3. Kliknij "Obrazowanie monochromatyczne" (aby zeskanować cały slajd w jasnym świetle pola i uzyskać sekwencyjne obrazy za pomocą obiektywu 4x).
         nuta: W ten sposób uzyskuje się przegląd slajdu w skali szarości.
      4. Kliknij "Znajdź okaz". Wybierz obszar tkanki, który ma zostać zeskanowany w niskiej rozdzielczości (4x): przytrzymaj "Ctrl" i kliknij pole za pomocą kursora, aby zaznaczyć lub odznaczyć pola (Rysunek 2A).
      5. Kliknij "LP Imaging" (obrazowanie 4x), aby uzyskać fluorescencyjny obraz z czerwonego niebieskiego i zielonego każdego pola.
      6. Aby wybrać pole HP, przytrzymaj "Ctrl" i kliknij pole za pomocą kursora, aby zaznaczyć lub odznaczyć pola odpowiadające obszarowi tkanki, który będzie skanowany w wysokiej rozdzielczości (20x). Wybierz 5 pól (Rysunek 2B).
      7. Kliknij "HP Imaging" (obrazowanie 20x), aby uzyskać wielospektralne akwizycje obrazu każdego pola (Rysunek 2C).
      8. Kliknij "Przechowywanie danych", aby zapisać obrazy w folderze wybranym na początku w LabID.
         nuta: Proces ten został podsumowany i zilustrowany na rysunku 2. Dla każdego kroku (wykrywanie tkanek, wybór pola) algorytm może być inkrementowany i trenowany przez użytkownika w celu uzyskania całkowicie zautomatyzowanego procesu skanowania.

Tabela 1: Skład buforowy TBS i TBST. TBS stosuje się do mieszanin przeciwciał i rozcieńczeń. W przypadku płukania wszystkie etapy wykonuje się z TBS, z wyjątkiem płukania po przeciwciałach pierwotnych, gdzie zaleca się TBST.

	Tbs	TBST (Do ustalenia)
Tris-HCl	0,05 mln	0,05 mln
Zawartość NaCl	0,15 mln	0,15 mln
Animacja 20	-	0,05%
ph	7,6	7,6
preparat	1 tabletka w 500 ml H2O

Tabela 2: Szczegółowy skład mieszanki przeciwciał do barwienia immunofluorescencyjnego CD8-PD-1-Tim-3. Dla każdej mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych, drugorzędowych i trzeciorzędowych rozcieńczenie, które należy wykonać w odpowiedniej objętości TBS, podaje się dla całkowitej objętości 1 ml. Dla jednego szkiełka całkowita objętość reakcji wynosi 100 μl dla powierzchni tkanki 2^cm2.

zł pkt.

Objętość przeciwciała pierwszorzędowego			Końcowe V= 1 ml
Królik anty-CD8	Mysz anty-PD-1	Koza anty-Tim-3	Tbs
1,6 μL	2 μl	30 μL	966,4 μL
Objętość przeciwciała drugorzędowego
Cyjan 5 anty-królik	Biotynylowany anty-mysz	Alexa Fluor 488 anty-koza	Tbs
3,3 μl	2 μl	2,5 μl	992,2
Objętość trzeciorzędowego przeciwciała
	Streptawidyna znakowana Cy3		Tbs
	3,3 μl		996,7

Wyniki

Rycina 1: Barwienie immunologiczne CD8-PD-1-Tim-3 na tkance zatopionej w parafinie migdałków. Skrawki tkanek zatopionych w parafinie zamiast skrawków kriokonserwowanych wybrano do potrójnego barwienia immunologicznego. Po odparafinowaniu i ponownym nawodnieniu zastosowano ten sam protokół barwienia, który został wcześniej opracowany dla skrawków kriokonserwowanych. Limfocyty T CD8 + znajdują się poz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Vectra 3 Zautomatyzowane ilościowe obrazowanie patologiczne	Perkin Elmer	CLS142338
Analiza komórkowa w formie 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
Oprogramowanie R	https://www.r-project.org
Pióro ograniczające Dakopen	Dako Dako	S2002
Tris Buffer Sól fizjologiczna TBS Tabletki	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7,6 100 tabletek
Tris Bufor soli fizjologicznej Tween 20 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 tabletek
System blokowania biotyny	Dako Dako	Zobacz materiał X0590	Awidyna 0,1% i Biotyna 0,01%
Normalna surowica osła	Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 017-000-001	Stężenie 5% obj./obj.
Fluoroshield z DAPI	Sigma-aldrich	Zobacz materiał F6057	Stężenie 1,5 μg/ml
Szkiełko nakrywkowe ze szkła dzianinowego	Knittel Gläser,	100039	24x60 mm 100 szkiełek nakrywkowych
Królik anty-CD8 Klon P17-V	Novus	NBP1-79055	stosować w dawce 4μg/ml
Mysz anty-PD-1 Klon NAT	Biblioteka ABCAM	ab52587	stosować w stężeniu 2 μg/ml
Koza anty-Tim-3	Prace badawczo-rozwojowe	AF2365	stosować w stężeniu 3 μg/ml
Królik anty-PD-L1 Klon SP142	Roche	7309457001	stosować w stężeniu 1 μg/ml
Mysz AF647 z oznaczeniem patelnia - Keratynowy klon C11	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy: 4528	stosować w stężeniu 0,5 μg/ml
Koza anty-ludzka gal9	Prace badawczo-rozwojowe	AF2045	stosować w stężeniu 0,3 μg/ml
Cyjan 5 sprzężony osioł anty-królik	Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona)	Nr kat. 711-175-152	stosować w stężeniu 5 μg/ml
Biotynylowane F(ab'2) osły anty-mysie IgG	Jackson Immunoresearch (badania immunologiczne Jacksona)	Nr kat. 715-066-150	stosować w stężeniu 3 μg/ml
Alexa Fluor488 sprzężona anty-kozia IgG osła	Biblioteka ABCAM	ab150133	stosować w stężeniu 5 μg/ml
Streptawidyna znakowana Cy3	Amersham	PA43001	stosować w stężeniu 3 μg/ml
Mysz z kontrolą ujemną IgG1	Dako Dako	Zobacz materiał X0931	stosować w stężeniu 2 μg/ml
IgG z surowicy koziej	Sigma-aldrich	Zobacz materiał I5256	stosować w stężeniu 3 μg/ml
IgG z surowicy króliczej	Sigma-aldrich	Zobacz materiał I5006	stosować w dawce 4μg/ml