$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wywoływanie komórek i infekcja wirusowa
- W 20–24 godziny przed zakażeniem wirusem, nasiona 5 x 104 ludzkich komórek fibroblastów płuc zarodkowych (HEL) lub innych komórek, które należy zbadać na 4-dołkowym 11 mm schodkowym szkiełku w pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ).
nuta: Każda studzienka powinna mieć 70-80% zbieżności komórek w momencie infekcji.
- Następnego dnia należy usunąć pożywkę wzrostową i zainfekować komórki wirusami w pożywce 199 w zakresie 4–10 pfu/komórkę. Inkubować komórki zakażone wirusem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W okresie inkubacji należy wstrząsać szkiełkiem.
- Po 1 godzinnej inkubacji usunąć Medium-199 i uzupełnić pożywką wzrostową.
nuta: Leki, które zakłócają różne fazy infekcji, mogą być dodawane na tym etapie lub przed wchłonięciem wirusa.
- Inkubować komórki zakażone wirusem w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez różną długość okresu infekcji.
2. Utrwalenie i przepuszczalność
- W odpowiednim momencie infekcji szybko przemyj zakażone komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 3 razy i dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu świeżo przygotowanego w PBS. Inkubuj komórki z paraformaldehydem przez 8-10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki w każdym dołku.
- Odessać paraformaldehyd i przemyć studzienki 200 μl PBS 3 razy. Całkowicie odessać PBS po 3praniu.
- Dodaj 100 μl 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego do każdej studzienki, aby przepuszczalność komórek przez 5–10 minut.
- Odessać niejonowy środek powierzchniowo czynny i przemyć studzienki 200 μl PBS 3 razy.
3. Barwienie immunofluorescencyjne
- Całkowicie odessać PBS i dodać 200 μl buforu blokującego (1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5% surowicy końskiej w PBS) do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
- Dodać eksperymentalnie określone stężenie pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko zakażonemu białku komórkowemu 0 (królicze przeciwciało poliklonalne anty-ICP0) w buforze blokującym i inkubować przeciwciało pierwszorzędowe w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.
- Przemyć buforem blokującym 3 razy w 10 minutowej inkubacji. Dodać sprzężone z Alexa 594 kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi (1:400 rozcieńczone w buforze blokującym) i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie umyj szkiełka 3 razy buforem blokującym w odstępach 10 minut.
- Na koniec umyj szkiełko raz PBS, aby usunąć resztki BSA i końskiej surowicy.
- Dodaj jedną kroplę podłoża mocującego antifade z 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI), aby zamontować szkiełko i uszczelnić je szkiełkiem nakrywkowym za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.
4. Obrazowanie konfokalne
- Za pomocą mikroskopu konfokalnego ustaw długość fali na 590–650 nm dla Alexa 594 i 410–520 nm dla DAPI. Wybierz format obrazu 1024 x 1024 i średnią liniową 8, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości.
- Przeanalizuj każdą studzienkę na szkiełku 4-dołkowym pod mikroskopem konfokalnym. Uzyskaj reprezentatywne obrazy komórek pod obiektywem 100X, jak pokazano na rysunku 1 i rysunku 2.
- Aby zliczyć dużą liczbę komórek, należy wykonać zdjęcia kolejnych pól pod obiektywem 40X.
nuta: Potrzeba 5-10 obrazów, aby zgromadzić ponad 200 zainfekowanych komórek z każdego punktu czasowego każdej infekcji.
- W każdym eksperymencie należy wykonać zdjęcia ze stałymi parametrami konfokalnymi dla wszystkich próbek, które mają być porównane.
5. Analiza dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej
- Otwórz projekt za pomocą oprogramowania konfokalnego. Wybierz obraz, z którego komórki muszą zostać zestawione w tabeli pod kątem dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej ICP0.
- Kliknij zakładkę "Ilość" w górnym menu i wybierz "sortuj ROI" z menu narzędzi.
- Narysuj linię podłużną w poprzek komórki, która ma być analizowana, wybierając "Rysuj linię" z górnego menu.
nuta: Pojawi się histogram pokazujący intensywność fluorescencji wzdłuż linii zarówno dla ICP0, jak i DAPI. Na histogramie niebieska linia reprezentuje piksele DAPI i wyznacza granicę jądra, podczas gdy czerwona linia reprezentuje piksele ICP0.
- Na podstawie barwienia tła ustaw stały próg intensywności ICP0, aby przeanalizować dystrybucję subkomórkową ICP0 w każdym eksperymencie.
- Jak pokazano na rysunku 2, jeśli czerwony sygnał jest średnio poniżej progu w obszarze jądrowym, ale jest powyżej progu poza niebieską granicą, należy sklasyfikować sygnał czerwony jako zlokalizowany głównie w cytoplazmie.
- Jeśli sygnał czerwony znajduje się powyżej progu w całym jądrze i poza granicą sygnału niebieskiego, pogrupuj sygnał czerwony jako jądro plus lokalizacja cytoplazmatyczna.
- Jeśli sygnał czerwony znajduje się powyżej progu w jądrze, ale średnio znajduje się poniżej niego poza granicą sygnału niebieskiego, należy pogrupować sygnał czerwony jako lokalizację jądrową.
- Sporządź tabelę ponad 200 zainfekowanych komórek z każdej próbki w różnym czasie infekcji i narysuj wykres słupkowy, aby zilustrować ruch ICP0 w zależności od czasu (ryc. 3).
