Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Chirurgiczne wycięcie i przygotowanie tkanek
- Poddaj mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1 ml tribromoetanolu (przygotowanego zgodnie ze standardowym protokołem; Tabela materiałów).
nuta: W badaniach płuc należy unikać uduszenia CO2 , ponieważ może ono spowodować uszkodzenie płuc oraz zmienić cechy i właściwości komórek odpornościowych płuc. Należy również unikać zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ może ono spowodować mechaniczne uszkodzenie płuc.
- Przenieś mysz do czystego i przeznaczonego do tego miejsca do operacji chirurgicznej.
- Ustabilizuj mysz grzbietową stroną do dołu za pomocą igieł lub taśmy na czterech kończynach. Użyj 70% etanolu do odkażenia skóry w okolicy brzusznej.
- Wykonaj nacięcie skóry, od szyi do brzucha. Ostrożnie usuń skórę z okolicy klatki piersiowej.
- Ostrożnie usuń mostek i żebra.
- Przepłukać płuca, wstrzykując 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bezpośrednio do prawej komory, za pomocą igły o sile 18-21 G, aż płuca staną się całkowicie białe.
- Ostrożnie usuń grasicę i serce, nie dotykając płuc.
- Delikatnie odłączyć płuca od otaczających tkanek i przenieść je do probówki z buforem zimnej albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (Tabela 1).
nuta: Należy dołożyć starań, aby usunąć cały przylegający tłuszcz z płuc przed dalszym przygotowaniem zawiesiny jednokomórkowej, ponieważ może to zniekształcić odczyty.
2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
- Przenieś płuca na pustą szalkę Petriego i zmiel je dwoma drobnymi skalpelami. Przenieść wszystkie kawałki rozdrobnionego płuca do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Użyć 5 ml buforu wytrawiającego do umycia płytki i dodać ją do 50 ml probówki zawierającej rozdrobnione płuco (Tabela 1).
nuta: Bufor do wytrawiania należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Należy użyć 5 mg/ml kolagenazy. Połączenie 1 lub 5 mg kolagenazy z buforem BSA lub PBS bez białka nie poprawiło wyników (ryc. 1).
- Zabezpieczyć pokrywę probówki i trawić płuca przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję, dodając 10 ml zimnego buforu BSA.
- Po strawieniu użyj igły 18 G, aby wymieszać i rozpuścić kawałki płuc. Umieść sitko filtra o pojemności 70 μm na górze nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Użycie mniejszego filtra mikronowego może spowodować utratę głównych populacji szpiku.
- Powoli przenieś strawioną mieszaninę płuc bezpośrednio na sitko. Użyj gumowej strony tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, aby rozbić pozostałe kawałki płuc na filtrze. Umyj przetworzony materiał na filtrze buforem BSA.
- Odwirować zawiesinę jednokomórkową o masie 350 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy amonowo-chlorkowo-potasowego (ACK). Dobrze wymieszać za pomocą pipety o pojemności 1 ml i inkubować przez 90 s w temperaturze pokojowej.
- Dodać 10 ml zimnego buforu BSA w celu zatrzymania reakcji i odwirować przy 350 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze barwiącym w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru.
- Zawiesić komórki w stężeniu 5 × 106 komórek/ml i użyć ich do barwienia powierzchni (patrz punkt 2).
nuta: W tym celu umieść komórki w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem, a następnie wytnij przeciwciała i przepłucz. Jeśli wirówka płytkowa nie jest dostępna, zamiast płytek należy użyć probówek przepływowych. Dzięki temu protokołowi od 6-10-tygodniowej myszy C57BL/6 średniej wielkości można uzyskać ~15-20 × 10 6 komórek na płuco.
3. Powierzchniowe barwienie przeciwciał
- Przenieś 1 × 106 komórek w 200 μl na studzienkę na płytkę 96-dołkową. Odwirować płytkę o masie 350 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. W międzyczasie należy przygotować roztwór bloku Fc, rozcieńczając przeciwciało anty-16/32 (1:100) w buforze barwiącym (Tabela 1).
- Zawiesić komórki w 50 μl wstępnie przygotowanego roztworu blokującego Fc (tabela materiałów) i inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
- Dodać 150 μl buforu barwiącego i odwirować płytkę o stężeniu 350 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W międzyczasie przygotuj koktajl przeciwciał powierzchniowych, rozcieńczając przeciwciała powierzchniowe (1:100; Tabela 2) w buforze do barwienia.
UWAGA: (i) Przeciwciało anty-16/32 do blokowania Fc może być stosowane z przeciwciałami powierzchniowymi w tej samej mieszaninie. (ii) Jeśli używany jest barwnik utrwalający żywotność, dodać go do powierzchniowego koktajlu przeciwciał w rozcieńczeniu 1:1,000.
- Zawiesić komórki w 50 μl wstępnie przygotowanego powierzchniowego koktajlu przeciwciał i inkubować przez 30-40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Dwukrotnie umyj komórki buforem barwiącym.
nuta: Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, ponownie zawieś komórki w 200 μl buforu barwiącego i przejdź bezpośrednio do pozyskiwania danych na cytometrze przepływowym. Alternatywnie, ogniwa mogą być utrwalone i przechowywane w temperaturze 4 °C w celu późniejszego pobrania. Zalecamy użycie komórek do cytometrii przepływowej w ciągu 24 godzin.
4. Utrwalanie komórek i barwienie wewnątrzkomórkowe
- Przygotować bufor do utrwalania/permeabilizacji (bufor do utrwalania/trwałej ondulacji) mieszając trzy części koncentratu do utrwalania/permeabilizacji i 1 część rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności zestawu barwiących FoxP3/czynnik transkrypcyjny (Tabela 1).
- Zawiesić komórki w 50 μl wstępnie przygotowanego buforu Fix/Perm na basenik płytki 96-dołkowej, na której komórki zostały posiane zgodnie z opisem w sekcji 3, i inkubować je przez 20-25 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
- Rozcieńczyć 10x bufor permeabilizacji w stosunku 1: 10 w oczyszczonej wodzie dejonizowanej, aby przygotować 1x bufor permeabilizacji.
- Umyj komórki raz 1x buforem do przepuszczalności. W międzyczasie przygotuj wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał, rozcieńczając przeciwciała wewnątrzkomórkowe (1:100) w 1 ml buforu permeabilizacji.
- Zawiesić komórki, używając 50 μl uprzednio przygotowanego powierzchniowego koktajlu przeciwciał na komórkę 96-dołkowej płytki i inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
- Umyj komórki raz buforem do permeabilizacji, a raz buforem barwiącym. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego.
nuta: Jeśli cytometr przepływowy z czytnikiem płytek nie jest dostępny, przenieś komórki do probówek do cytometrii przepływowej.
- Pobrać co najmniej 1,5 × 106 komórek na próbkę cytometru przepływowego.
nuta: W przypadku pojedynczych kolorów i niebarwionych próbek kontrolnych wystarczy 0,5-1 × 106 komórek na próbkę. Zaleca się mianowanie poszczególnych stosowanych przeciwciał w celu uzyskania optymalnego barwienia i obniżenia kosztów. Niniejszy protokół został zoptymalizowany przy użyciu bufora Fix/Perm przygotowanego przy użyciu zestawu barwiących FoxP3. Ponieważ CD68 jest markerem cytoplazmatycznym, a nie jądrowym, inne roztwory przepuszczalności, takie jak niskie stężenie paraformaldehydu lub zestawy cytofix / cytoperm od różnych dostawców, mogą być wystarczające.
Tabela 1:.
| Bufor BSA | PBS + 0,5% Albumina surowicy bydlęcej |
| Bufor mineralizacyjny | Wstępnie podgrzany (37 °C) bufor BSA + 5 mg/ml kolagenazy typu 1 + 0,2 mg/ml DNazy I |
| Bufor do barwienia | PBS + 2,5% FBS |
| Bufor Fix/Perm | Trzy części rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności i 1 część rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności zestawu barwiących Foxp3/czynnik transkrypcyjny |
| Bufor przepuszczalności | 10x bufor permeabilizacji z zestawu barwiących Foxp3/Transcription Factor rozcieńczony 10 razy w oczyszczonej wodzie dejonizowanej |
Tabela 2: Stosowanie przeciwciał monoklonalnych.
powiedział:
powiedział:
Nożnej (
powiedział:
powiedział:
powiedział:
Nożnej (
powiedział:
| antygen | klon | Fluorochrom | Rozcieńczeniu | Powierzchniowe/wewnątrzkomórkowe |
| Płyta CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | Powierzchnia |
| Gr-1 | Zobacz materiał RB6-8C5 | Zobacz materiał BV421 | 1:100 | Powierzchnia |
| Płyta CD68 | FA-11 (wersja angielska) | PerCPCy5.5 | 1:100 | Wewnątrzkomórkowych |
| Płyta CD11b | Zobacz materiał M1/70 | PECy7 | 1:100 | Powierzchnia |
| Siglec F | S17007L | Międzynarodowa Federacja Piłki | 1:100 | Powierzchnia |
| Płyta CD11c | N418 | BV650 lub BV510 | 1:100 | Powierzchnia |
| Płyta CD64 | Zobacz materiał X54-5/7.1 | PE/Dazzle 594 | 1:100 | Powierzchnia |
| MHC-II (Przekaźnik Miniaturowy) | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | Powierzchnia |
| Płyta CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | Powierzchnia |
| Żywy/martwy zestaw do naprawy dalekiego odczytu z martwych komórek | | FarRed (APC) lub Aqua (BV510) | 1:1000 | Powierzchnia |
| Płyta CD3 | Zobacz materiał 17A2 | Pe | 1:100 | Powierzchnia |
| Zobacz materiał B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | Powierzchnia |
| NK1.1 | Zobacz materiał PK136 | Międzynarodowa Federacja Piłki | 1:100 | Powierzchnia |
| Płyta CD24 | 30-F1 | Pe | 1:100 | Powierzchnia |
| MERTK | pozycji 2B10C42 | Pe | 1:100 | Powierzchnia |
| Rozmiar F4/80 | Zobacz materiał BM8 | Zobacz materiał BV605 | 1:100 | Powierzchnia |
| CX3CR1 | SA011F11 | Pe | 1:100 | Powierzchnia |
| FcBlock (CD16/32) | 93 Rozdział 93 | | 1:100 | Powierzchnia |
