$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie komórek kryptokokowych
- Usunąć badany organizm za pomocą pętli inokulacyjnej na sterylną płytkę agarową z ekstraktem słodu drożdżowego (YM).
- Inkubować płytkę agarową w temperaturze 30°C przez 48 godzin.
- Użyj pętli do zaszczepiania, aby zgarnąć 5 pojedynczych kolonii i zawiesić je w 5 ml sterylnej wody destylowanej.
- Standaryzacja komórek przy użyciu wzorca McFarlanda, aby uzyskać stężenie komórek między 0,5 × 105 a 2,5 × 105 jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml pożywki RPMI-1640.
- Dozować zawiesinę komórkową o objętości 100 μl do studzienek z płytkami do mikromiareczkowania, które zawierają wysiane makrofagi (patrz sekcja poniżej).
2. Przygotowanie makrofagów
- Hoduj mysią linię komórkową makrofagów, RAW 264.7, na kolbie tkankowej zawierającej 10 ml pożywki RPMI-1640, uzupełnionej 20 mg / ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 20 U / ml penicyliny i 10% płodowej surowicy bydlęcej.
- Umieścić kolbę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 ustawionym w temperaturze 37°C, aż do uzyskania 80% konfluencji.
- Delikatnie zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek.
- Przenieść zawieszone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Użyj niebieskiego barwnika trypanowego, aby określić żywotność komórek.
nuta: Preferowany jest wynik rentowności powyżej 85%.
- Użyj hemocytometru, aby dostosować stężenie komórek makrofagów do 1 × 106 komórek/ml za pomocą 10 ml roztworu świeżej, sterylnej pożywki RPMI-1640.
- Dozować 100 μl zawiesiny komórek do studzienek sterylnej 96-dołkowej płaskodennej płytki do mikromiareczkowania.
- Inkubować płytkę przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37°C.
nuta: Przed użyciem zużyte przez noc pożywki należy odessać i zastąpić 100 μl świeżych, sterylnych pożywek Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640).
3. Przygotowanie mieszanki
- Rozpuść testowe fotouczulacze i prymachinę (PQ) w wodzie destylowanej, aby przygotować roztwór podstawowy.
- Rozcieńczyć związek dalej w pożywce RPMI-1640.
nuta: Ostateczna ilość wody destylowanej w mediach RPMI-1640 nigdy nie powinna przekraczać 1%.
- Dozować 100 μl roztworu przygotowanego fotouczulacza, aby czterokrotnie zwiększyć pożądane stężenie do odpowiednich studzienek zawierających już wysiane makrofagi i komórki kryptokokowe.
4. Implementacja leczenia fotodynamicznego (PDT)
- Skonfiguruj następujące warunki eksperymentalne:
- Współhodowane komórki z 0 μM PQ i wystawione na działanie ciemnego światła (DL) przez 2 minuty (tj. komórki niepoddane działaniu substancji (nie-Rx))
- Współhodowane komórki z 6 μM i wystawione na działanie DL przez 2 minuty (tj. efekt leku)
- Współhodowane komórki 15 μM PQ i wystawione na działanie DL przez 2 minuty (tj. efekt leku)
- Współhodowane komórki z 30 μM PQ i wystawione na działanie DL przez 2 minuty (tj. efekt leku)
- Współhodowane komórki z 0 μM PQ i wystawione na działanie ultrafioletu (UV) przez 2 minuty (efekt UV)
- Współhodowane komórki z 6 μM PQ i wystawione na działanie światła ultrafioletowego (UVL) przez 2 minuty (tj. efekt PDT)
- Współhodowane komórki z 15 μM PQ i wystawione na działanie UVL przez 2 minuty (tj. efekt PDT)
- Współhodowane komórki z 30 μM PQ i wystawione na działanie UVL przez 2 minuty (tj. efekt PDT)
nuta: Współhodowane komórki muszą reagować z PQ przez 30 minut w ciemności (w stosownych przypadkach), przed wystawieniem na działanie promieniowania UVL (w stosownych przypadkach).
nuta: W obecnych pracach ustaliliśmy, że PQ ma absorpcję UV/Vis 260 nm, co mieści się w zakresie UV lampy bakteriobójczej. Ze względu na to ostatnie użyliśmy bakteriobójczej lampy ultrafioletowej C (UVC) zamontowanej w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II jako źródła światła do realizacji PDT. Podaje się, że lampa ma moc nominalną 30 watów. Komórki były trzymane w odległości około 20 cm od lampy w obecnym badaniu. Szacuje się, że przy tej odległości lampa ma moc promieniowania 625 μW/cm2.
5. Liczenie kolonii w celu określenia przetrwania komórek kryptokokowych
- Po rozpoczęciu obróbki fotodynamicznej współhodowanych komórek, jak wskazano powyżej, inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5 % CO2 przez 18 godzin.
- Po 18 godzinach odessać supernatant.
- Przemyć studzienki 200 μl roztworu buforu fosforanowego (PBS), aby zmyć niezinternalizowane komórki. Powtórz ten krok trzy razy.
- Dodać 300 μl 0,1% Triton X-100 do studzienek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Odessać zawartość studzienek i przelać ją do sterylnych plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml.
- Przygotować rozcieńczenie komórek w stosunku 1 do 10 wodą destylowaną.
nuta: Dostosuj rozcieńczenie tak, aby możliwe było odzyskanie od 30 do 300 kolonii na płytkach agarowych.
- Odpipetować 50 μl rozcieńczenia na płytkę agarową ze słodu drożdżowego (YM).
- Użyj metody płytki rozprowadzającej, aby utworzyć trawnik zbiegający się komórek na powierzchni płytki agarowej.
- Inkubować płytki w temperaturze 30°C przez 48 godzin.
- Policz jednostki tworzące kolonie (CFU) rozwinięte na płytkach agarowych.