Wpływ aspiryny i ibuprofenu na zdolność fagocytarną makrofagów

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten film prezentuje metodę oceny wpływu aspiryny i ibuprofenu, przy ich minimalnych stężeniach hamujących, na fagocytozę makrofagów przy użyciu wrażliwych na pH komórek grzybów barwionych barwnikiem fluorescencyjnym. Leki hamują cyklooksygenazę-2, zmniejszając tworzenie prostaglandyn i zwiększając fagocytozę makrofagów, co obserwuje się za pomocą pomiarów fluorescencji barwnika wrażliwego na pH.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Względy bezpieczeństwa

Personel powinien używać środków ochrony osobistej (PPE).
Z patogenem i makrofagami należy obchodzić się w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

2. Przygotowanie makrofagów

Hoduj mysią linię komórkową makrofagów, RAW 264.7, w kolbie tkankowej zawierającej 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), uzupełnionej 20 mg / ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 20 U / ml penicyliny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
Umieścić kolbę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla (CO_{2 )} ustawionym w temperaturze 37°C, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.
Delikatnie zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek.
Przenieść zawieszone komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
Użyj barwienia błękitem trypanowym, aby określić żywotność komórek.
nuta: Preferowany jest wynik rentowności powyżej 85%.
Użyj hemocytometru, aby dostosować stężenie komórek makrofagów do 1 × 10⁵ komórek/ml za pomocą 10 ml roztworu świeżej, sterylnej pożywki RPMI-1640. Dozować 100 μl zawiesiny komórek do studzienek sterylnej 96-dołkowej płaskiej płytki do mikromiareczkowania. Inkubować płytkę przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37°C.
nuta: Pożywkę zużytą przez noc należy odessać i zastąpić 100 μl świeżej, sterylnej pożywki RPMI-1640 przed użyciem.

3. Przygotowanie komórek kryptokokowych

Usunąć badany organizm za pomocą pętli inokulacyjnej na sterylną płytkę agarową z ekstraktem słodu drożdżowego (YM).
Inkubować płytkę agarową w temperaturze 30°C przez 48 godzin.
Za pomocą pętli inokulacyjnej zaszczepij pętlę pełną komórek w 100 ml bulionu z drożdżowej zasady azotowej (YNB) uzupełnionego 4% glukozą.
Hoduj komórki (hodowla wstępna) przez noc, wstrząsając z prędkością 160 obr./min w temperaturze 30°C.
Następnego dnia zaszczepij 0,1 ml kultury wstępnej w świeżym bulionie YNB (kultura główna) i pozwól komórkom rosnąć do środkowej fazy wykładniczej (w tych samych warunkach uprawy).
Przemyć komórki dwukrotnie roztworem buforu fosforanowego (PBS).
Za pomocą hemocytometru standaryzuj komórki do 1 x 10⁵ w PBS.

4. Barwienie komórek kryptokokowych barwnikiem fagocytozy

Dozuj 999 μl komórek do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml.
Do tej samej probówki dodać 1 μl barwnika pHrodo green zymosan A.
Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, w ciemności, powoli mieszając, aby zareagowały z plamą.
Pod koniec okresu inkubacji przemyć komórki trzykrotnie PBS.
Dozować zawiesinę komórkową o objętości 100 μl do studzienek zawierających makrofagi z nasionami.

5. Przygotowanie leków

Przygotować podstawowy roztwór aspiryny, używając 1 mg aspiryny w 1000 ml absolutnego alkoholu etylowego do końcowego stężenia 1000 μg/ml.
Rozcieńczyć związek dalej w pożywce RPMI-1640, aby osiągnąć pożądane stężenia leku.
nuta: Ostateczna ilość etanolu w mediach RPMI-1640 nigdy nie powinna przekraczać 1%. Przygotować roztwór podstawowy ibuprofenu, używając 1 mg ibuprofenu w 1000 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć związek dalej w pożywce RPMI-1640, aby osiągnąć pożądane stężenia leku.
nuta: Ostateczna ilość DMSO w mediach RPMI-1640 nigdy nie powinna przekraczać 1%. Przygotować 100 μl roztworu przygotowanych leków o czterokrotnym pożądanym stężeniu i dozować do odpowiednich studzienek zawierających wysiane makrofagi i komórki kryptokokowe.

6. Wpływ czynników uczulających na chemo-uczulanie na fagocytozę makrofagów

Inkubować płytki z komórkami z kokulturą w obecności czynników uczulających na chemo, aspiryny lub ibuprofenu w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37°C przez 2 godziny lub 6 godzin.
Pod koniec okresu inkubacji zmierzyć indukowaną fluorescencję (np. 492 nm i em: 538 nm).
nuta: Barwnik pHrodo fluoryzuje tylko w środowisku kwaśnym, na przykład wewnątrz fagosomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa

Firma

Numer katalogowy

Komentarze

agar

Merck