Metoda immunofluorescencyjna do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii

Streszczenie

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny przeznaczony do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV). Przeciwciała specyficzne dla wirusa miesza się z wirusem i inkubuje z ludzkimi komórkami fibroblastów. Przeciwciała neutralizują wirusa, uniemożliwiając mu infekowanie komórek gospodarza, podczas gdy niezneutralizowane wirusy infekują komórki. Po inkubacji stopień neutralizacji określa się poprzez ilościowe oznaczanie komórek zakażonych wirusem za pomocą immunofluorescencji.

Protokół

1. Przygotowanie komórek docelowych do infekcji

1. Nasiona komórek docelowych na dzień przed przeprowadzeniem eksperymentu na 96-dołkowej płytce ("płytce docelowej").
2. Ułóż wystarczającą ilość komórek w studzience, aby zapewnić prawie zlewającą się (~90%) monowarstwę.
   nuta: Będzie to zależeć od względnego rozmiaru docelowego typu komórki. Jeśli używasz ludzkich fibroblastów napletka (HFF), wysiewaj 20 000 komórek / studzienkę.
3. Zazwyczaj należy wysiać 21 dołków (7 w dół na 3 w poprzek) na próbkę, co pozwala na analizę 4 próbek na płytkę.
4. Wysiewaj dodatkowe 12 dołków na płytkę (tj. rząd 8), aby służyły jako kontrole.

2. Przygotowanie wirusa: mieszaniny przeciwciał

1. Dodać 90 μl pożywki połączonej z przeciwciałem (i dobrze wymieszanej) w celu wytworzenia dwukrotnie pożądanego początkowego stężenia przeciwciał testowych do 3 dołków rzędu 1 świeżej płytki 96-dołkowej (płytki "rozcieńczającej").
   nuta: Typowe stężenie wyjściowe przeciwciała wynosiłoby 20 μg/ml, ale powinno być określone empirycznie.
2. Dodaj 60 μl pożywki do każdego z 18 dołków poniżej (tj. 6 w dół na 3 w poprzek) 3 dołków z kroku 2.1.
3. Dodaj 60 μl pożywki do 12 dodatkowych studzienek (tj. rząd 8).
4. Przenieść 30 μl rozcieńczenia przeciwciała z rzędu 1 do odpowiednich studzienek w rzędzie 2.
5. Wymieszaj zawartość rzędu 2, pipetując płynnie w górę i w dół 20 razy za pomocą pipety wielokanałowej.
6. Przenieść 30 μl rozcieńczenia przeciwciał z rzędu 2 do rzędu 3.
7. Powtarzaj ten proces mieszania i przenoszenia, aż zawartość rzędu 7 zostanie wymieszana.
8. Po wymieszaniu rzędu 7 wyrzucić 30 μl z dołków w rzędzie 7.
9. Rozcieńczyć HCMV w kompletnym pożywce, tak aby 50 μl zawierało wystarczającą ilość cząstek zakaźnych, aby spowodować infekcję MOI=1, jeśli zostaną dodane bezpośrednio do komórek.
   nuta: HCMV jest patogenem kategorii bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Upewnij się, że obowiązują odpowiednie procedury bezpieczeństwa i używaj końcówek filtrujących do wszystkich mediów narażonych na HCMV.
   nuta: Wymaga to takiej samej liczby zakaźnych cząstek, jak jest w komórkach/studni, która będzie się różnić w zależności od typu komórki i tropizmu wirusa. W przypadku stosowania HFF zgodnie z powyższym opisem, wymagane stężenie wirusa wynosi 4x10⁵ pfu/mL.
   nuta: Upewnij się, że przygotowany jest wystarczający nadmiar rozcieńczonego wirusa (np. 10% ekstra).
10. Dodać 60 μl rozcieńczonego preparatu wirusowego do wszystkich studzienek zawierających rozcieńczenia przeciwciał i 6 studzienek, które zawierają tylko 60 μl pożywki.
11. Dodaj 60 μl pożywki tylko do pozostałych 6 dołków pożywki, aby służyły jako niezainfekowane kontrole.
12. Inkubować powstałego wirusa: mieszaniny przeciwciał w temperaturze 37^oC przez 1 godzinę.

3. Zakażenie komórek docelowych

1. Usuń wszystkie nośniki z komórek docelowych.
2. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl mieszaniny wirusa: przeciwciała z płytki "rozcieńczającej" na komórki w równoważnej pozycji na płytce "docelowej".
3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny.

4. Utrwalenie komórek

1. Usuń wszystkie nośniki z cells.
   nuta: W tym momencie nie ma potrzeby wymiany końcówek między studzienkami.
2. Umyć wszystkie studzienki 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wyjąć.
3. Do wszystkich studzienek dodać 180 μL -20 ^oC, 100% etanolu.
4. Inkubować płytkę w temperaturze -20 ^oC przez co najmniej 30 min.
   nuta: Ten etap można przedłużyć do co najmniej jednego miesiąca, pod warunkiem, że w miarę jak zaczyna parować, zostanie dodany dodatkowy etanol.
   nuta: Od tego momentu płytka jest bezpieczna w obsłudze w warunkach BSL-1 i można używać końcówek bez filtra.

5. Wykrywanie komórek zakażonych wirusem za pomocą immunofluorescencji (IF)

1. Usuń etanol z talerza.
2. Umyj wszystkie studzienki 200 μl PBS i wyjmij.
3. Dodać 200 μl PBS do wszystkich studzienek i inkubować przez 5 minut.
   1. W międzyczasie przygotuj pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w PBS.
   2. Wymagane będzie 100 μl mysiego monoklonalnego anty-IE w skali 1:2000 na studzienkę (należy zauważyć, że rozcieńczenie dotyczy specyficznego przeciwciała wymienionego w materiałach).
      UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciała stosowanego w IF może wymagać optymalizacji, jeśli stosowana jest alternatywa.
   3. Mieszaj wirowo, aby zapewnić wystarczające wymieszanie.
4. Usunąć PBS ze wszystkich studzienek i dodać 100 μl rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych.
5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
6. Usuń przeciwciało pierwotne ze wszystkich studzienek.
7. Dodać 200 μl PBS i inkubować przez 5 minut.
   1. W międzyczasie przygotuj przeciwciało drugorzędowe i rozcieńczenie 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) w PBS.
   2. Wymagane będzie 100 μl anty-mysiej IgG sprzężonej z fluoroforem w stosunku 1:2000 i 1 μg / ml DAPI na studzienkę.
   3. UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego stosowanego w IF może wymagać optymalizacji, jeśli stosowana jest alternatywa.
   4. Mieszaj wirowo, aby zapewnić wystarczające wymieszanie.
8. Usunąć PBS ze wszystkich studzienek i dodać 100 μl przeciwciała wtórnego/rozcieńczenia DAPI.
9. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, chroniąc przed światłem.
10. Usuń przeciwciało wtórne/DAPI ze wszystkich studzienek.
11. Umyj wszystkie studzienki 200 μl PBS i wyjmij.
12. Dodać 200 μl PBS do wszystkich studzienek i inkubować przez 5 minut.
13. Usunąć PBS i dodać 100 μl PBS do wszystkich studzienek i przechowywać, chroniąc przed światłem, w temperaturze 4 ^oC do momentu przygotowania do obrazu.
    nuta: Płyty mogą być przechowywane przez okres do jednego miesiąca przy minimalnej utracie jakości sygnału/obrazu.

6. Obrazowanie i liczenie zainfekowanych komórek

1. Aby łatwo i dokładnie określić ilościowo infekcję, zobrazuj co najmniej 25% każdej studzienki, zarówno w kanale niebieskim (DAPI, jądra), jak i przeciwciała drugorzędowym (HCMV immediate-early protein (IE)).
   nuta: Sygnał generowany przez immunofluorescencję IE powinien przypominać sygnał barwienia jądrowego i należy sprawdzić obrazy, aby to potwierdzić.
2. Można to zrobić ręcznie, ale zaleca się użycie mikroskopu automatycznego.
   nuta: Powiększenie będzie zależało od instrumentu, ale ponieważ obrazowane są duże struktury (jądra), zazwyczaj wystarczają obiektywy 4X/10X.
3. Po uzyskaniu obrazów przetworzyć je za pomocą wybranego programu do analizy oprogramowania.
   1. Najpierw zidentyfikuj jądra za pomocą niebieskiego kanału, aby obliczyć liczbę obecnych komórek.
   2. Tylko te obszary muszą być następnie sprawdzone pod kątem sygnału w kanale czerwonym, ponieważ IE jest białkiem zlokalizowanym jądrowo, aby obliczyć liczbę zainfekowanych komórek.
4. Po obliczeniu liczby zakażonych komórek i całkowitej liczby komórek oblicz procent infekcji na podstawie dołka.
5. Wartości te można skorygować o poziomy wykrywania tła, odejmując średni odsetek infekcji zaobserwowany w niezainfekowanych studniach od wszystkich innych studzienek.
   nuta: Powinno to być znacznie poniżej 1%. Jeśli jest większy niż 1%, procedura analizy wymaga optymalizacji.
6. Te skorygowane w tle wartości mogą być teraz wykreślane, badane i analizowane zgodnie z potrzebami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mysi klon przeciwciała monoklonalnego anty-IE 6F8.2	Milipory	MAB8131	Pierwszorzędowe przeciwciało immunofluorescencyjne
Królicze przeciwciało anty-mysie IgG, sprzężone przeciwciało Alexa fluor 568	Invitrogen	A-11061	Przeciwciało drugorzędowe immunofluorescencji
System obrazowania WiScan® Hermes o wysokiej zawartości	Idea biomedyczna	-	Wysokowydajny, zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny do oznaczania ilościowego
Oprogramowanie do analizy obrazu Metamorph	Urządzenia molekularne	-	Oprogramowanie do analizy obrazu
Kontrola izotypu ludzkiej IgG1	Merck	Zobacz materiał M5284	Przeciwciało kontrolne do neutralizacji
8F9, przeciwciało przeciwko glikoproteinie B anty-HCMV	-	-	Przeciwciało neutralizujące dla HCMV
DAPI (interfejs DAPI)	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 62248	Barwienie jąder komórkowych
DMI4000B Mikroskop z odwróconą fluorescencją	Księga Leica	-	Mikroskop fluorescencyjny używany do reprezentatywnych obrazów