Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Abstract

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Protocol

1. Kowalencyjne sprzężenie przeciwciał wychwytujących z mikrosferami MagPlex

Każde przeciwciało wychwytujące jest sprzężone z określonym zestawem karboksylowanych mikrosfer magnetycznych za pomocą dwuetapowej procedury, jak opisano poniżej.

UWAGA: Dostępny jest również zestaw sprzęgający zawierający wszystkie odczynniki, i materiały potrzebne do sprzężenia mikrosfery (patrz TABELA MATERIAŁÓW).

1. Zawiesić odłączoną zawiesinę mikrosferyczną zgodnie z instrukcjami opisanymi w karcie informacyjnej produktu dołączonej do urządzenia microspheres.
   

Results

Rysunek 1: Przebieg pracy wielopoziomowego testu immunologicznego typu sandwich. Do każdej studzienki dozuje się multipleksowaną mieszaninę mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami i dodaje się próbkę. Po inkubacji przez 1 godzinę reakcje przemywa się i dodaje biotynylowane przeciwciała wykrywające. Po 1-godzinnej inkubacji reakcje są ponownie przemywane i dodawany jest reporter SAPE........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikrosfery MagPlex®	Luminex®	MC100xx-YY	Indywidualne numery katalogowe znajdują się na stronie internetowej (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order)
Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml	Eppendorf™	22431081	Białko LoBind®
0,1 M jednozasadowy fosforan sodu (NaH2PO4), pH 6,2	MiliporeSigma	Zobacz materiał S3139	Bufor aktywacji
Chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC)	Thermo Scientific™	Pierce™ 77149
N-hydroksysulfosukcynimid (Sulfo-NHS)	Thermo Scientific ™	Przekłucie™ 24510
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4	MiliporeSigma	Zobacz materiał P3813	Bufor sprzęgający
Zestaw do sprzęgania przeciwciał xMAP®	Luminex®	40-50016	Dostępny opcjonalny zestaw do sprzęgania mikrosferycznego.
Przeciwciało anty-Escherichia coli O157:H7	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0326	Poliklonalny, używany zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
Przeciwciało anty-Salmonella CSA-Plus	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0321	Poliklonalny, używany zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
Przeciwciało anty-Campylobacter spp.	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0324	Poliklonalny, używany zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
Przeciwciało anty-Listeria	SeraCare (Opieka Medyczna)	Nr kat. 5310-0319	Poliklonalne, specyficzne dla rodzaju, używane zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
PBS, pH 7,4 zawierający 0,02% Tween-20, 0,1% BSA, 0,05% azydku sodu (PBS–TBN)	MiliporeSigma	P3563 A7888 Zobacz materiał S8032	Można użyć do 1% BSA
Przeciwciało anty-Escherichia coli O157:H7	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0326	Poliklonalny
(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna) (Pierce).	Thermo Scientific™	A39257
E. coli O157:H7	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0013	Zabity termicznie
Salmonella serotyp Typhimurium	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0002	Zabity termicznie
Campylobacter jejuni	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0011	Zabity termicznie
Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes)	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0010	Zabity termicznie
Streptawidyna, koniugat R-fikoerytryny (SAPE)	Thermo Scientific™	Zobacz materiał S866