Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Streszczenie

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Protokół

1. Kowalencyjne sprzężenie przeciwciał wychwytujących z mikrosferami MagPlex

Każde przeciwciało wychwytujące jest sprzężone z określonym zestawem karboksylowanych mikrosfer magnetycznych za pomocą dwuetapowej procedury, jak opisano poniżej.

UWAGA: Dostępny jest również zestaw sprzęgający zawierający wszystkie odczynniki, i materiały potrzebne do sprzężenia mikrosfery (patrz TABELA MATERIAŁÓW).

1. Zawiesić odłączoną zawiesinę mikrosferyczną zgodnie z instrukcjami opisanymi w karcie informacyjnej produktu dołączonej do urządzenia microspheres.
   nuta: Instrukcje dotyczące ponownego zamieszania będą zależeć od rozmiaru i objętości standardowych fiolek z mikrosferą.
2. Przenieś 2,5 x 10⁶ podstawowych mikrosfer do zalecanej probówki do mikrowirówki (patrz TABELA MATERIAŁÓW).
3. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund.
4. Trzymając rurkę nadal umieszczoną w separatorze magnetycznym, usuń supernatant.
   nuta: Uważaj, aby nie naruszyć mikrosfer.
5. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić mikrosfery w 100 μl dH₂O za pomocą wiru i sonikacji przez 20 sekund.
6. Powtórz kroki 3 i 4.
7. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić umyte mikrosfery 80 μL 0,1 M jednozasadowego fosforanu sodu, pH 6,2 przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund.
8. Dodać 10 μl 50 mg/ml N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS) (rozcieńczonego w 0,1 M jednozasadowym fosforanie sodu, pH 6,2) do mikrosfer i delikatnie wymieszać wirowo.
9. Dodać 10 μl 50 mg/ml chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) (rozcieńczonego w 0,1 M jednozasadowym fosforanie sodu, pH 6,2) do mikrosfer i delikatnie wymieszać wirowo.
10. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem wirowym w odstępach 10-minutowych.
11. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund.
12. Trzymając rurkę nadal umieszczoną w separatorze magnetycznym, usuń supernatant.
    nuta: Uważaj, aby nie naruszyć mikrosfer.
13. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić mikrosfery w 250 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), pH 7,4 przez wirowanie i sonikację przez około 20 sekund.
14. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund.
15. Trzymając rurkę nadal umieszczoną w separatorze magnetycznym, usuń supernatant.
    nuta: Uważaj, aby nie naruszyć mikrosfer.
16. Powtórz kroki 13-15, co daje w sumie dwa prania.
17. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić aktywowane i umyte mikrosfery w 100 μl PBS o pH 7,4 za pomocą wiru i sonikacji przez około 20 sekund.
18. Dodać 12,5 μg przeciwciała wychwytującego do zawieszonych mikrosfer (tj. 5 μg/1 milion mikrosfer).
    nuta: Do wychwytywania preferowane są przeciwciała monoklonalne, ale można również stosować przeciwciała poliklonalne.
    UWAGA: 5 μg białka na 1 milion kulek zwykle działa dobrze, ale zalecamy miareczkowanie ilości, aby osiągnąć optymalną wydajność testu.
19. Doprowadzić całkowitą objętość do 500 μl za pomocą PBS, pH 7,4.
20. Wymieszaj reakcję sprzężenia przez wir.
21. Inkubować przez 2 godziny z mieszaniem na przemian w temperaturze pokojowej w ciemności.
22. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund.
23. Gdy rurka nadal znajduje się w separatorze magnetycznym, usuń supernatant.
    nuta: Uważaj, aby nie naruszyć mikrosfer.
24. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery w 1 ml PBS o pH 7,4 zawierającym 0,02% Tween-20, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,05% azydku sodu (PBS-TBN) przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund.
25. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund.
26. Trzymając rurkę nadal umieszczoną w separatorze magnetycznym, usuń supernatant.
    nuta: Uważaj, aby nie naruszyć mikrosfer.
27. Powtórz kroki 24-26, co daje w sumie dwa prania.
28. Wyjąć rurkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery w 500 μl PBS-TBN.
    nuta: Określ liczbę odzyskanych mikrosfer za pomocą licznika komórek lub hemocytometru.
29. Sprzężone mikrosfery należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2-8°C w ciemności.
    nuta: Dostępny jest również protokół potwierdzający sprawność sprzężenia.

2. Oznaczanie przeciwciał wykrywających biotynę

1. Przeciwciała detekcyjne znakowano biotyną za pomocą heksanianu sulfosuccinimidylo-6-(biotinamido) EZ-Link zgodnie z instrukcjami producenta z 20-krotnym nadmiarem molowym odczynnika biotyny, aby uzyskać 4-6 grup biotyny na cząsteczkę przeciwciała.
   nuta: Przeciwciała poliklonalne są zwykle używane do wykrywania, ale przeciwciała monoklonalne mogą być również stosowane, jeśli są specyficzne dla innego epitopu niż przeciwciało wychwytujące.
   nuta: Alternatywnie do wykrywania można zastosować dostępne w handlu biotynylowane przeciwciała.

3. Wykrywanie organizmów za pomocą wielopoziomowego testu immunologicznego typu sandwich

Sprzężone zestawy mikrosfer i znakowane przeciwciała detekcyjne wygenerowane w punktach 1 i 2 powyżej są używane w multipleksowanym teście immunologicznym typu sandwich do wykrywania i ilościowego oznaczania bakterii obecnych w próbce. Przegląd przebiegu badania przedstawiono na rysunku 1.

1. Wybierz standardowe fiolki z zestawami kulek MagPlex sprzężonych z przeciwciałami z przechowywania w temperaturze 2-8ºC.
2. Wiruj i sonikuj przez 20 sekund.
3. Przygotuj roboczą multipleksowaną mieszankę kulek tak, aby każdy zestaw kulek osiągnął końcowe stężenie 2500 mikrosfer na 50 μl dla każdej studzienki reakcyjnej (50 000 kulek/zestaw/ml) w PBS-TBN.
   nuta: Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby określić parametry przygotowania do roboczej mieszanki ściegów.
   nuta: Kulki kontroli wewnętrznej (mikrosfery monitora RP1) mogą być również dołączone do monitorowania wydajności testu i urządzenia.
4. Odpipetować 50 μl kulki roboczej wymieszać do odpowiednich dołków na 96-dołkowej płytce.
5. Odpipetować 50 μl wzorca lub próbki do odpowiednich studzienek.
6. Odpipetować 50 μl PBS-TBN do każdej studzienki tła.
7. Przykryć płytkę uszczelką foliową w celu ochrony kulek przed światłem i inkubować na wytrząsarce płytek w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem z prędkością 800 obr./min.
8. Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytowym na 1 minutę.
9. Trzymając płytkę na magnetycznym separatorze płytowym, ostrożnie usuń folię i odwróć płytkę, aby opróżnić studzienki, a następnie postukaj, aby wysuszyć grubą warstwę laboratoryjnych ręczników papierowych 3-4 razy.
   nuta: Alternatywnie można ręcznie zassać studzienki za pomocą pipety wielokanałowej lub użyć automatycznej myjki do płyt.
10. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 200 μl PBS-TBN do każdej studzienki i wstrząsaj przez 1 minutę na wytrząsarce płytkowej z prędkością 800 obr./min.
11. Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytowym na 1 minutę.
12. Trzymając płytkę na magnetycznym separatorze płytowym, odwróć płytkę, aby opróżnić studzienki, a następnie postukaj, aby wysuszyć grubą warstwę laboratoryjnych ręczników papierowych 3-4 razy.
    nuta: Alternatywnie można ręcznie zassać studzienki za pomocą pipety wielokanałowej lub użyć automatycznej myjki do płyt.
13. Powtórz kroki 10-12, aby uzyskać łącznie dwa prania.
    nuta: Usuń jak najwięcej buforu przed przejściem do następnego kroku, aby uniknąć potencjalnego rozcieńczenia reakcji.
14. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl buforu do każdego dołka i wstrząsaj przez 1 minutę na wytrząsarce płytkowej z prędkością 800 obr./min.
15. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało wykrywające do 4 μg/ml w PBS-TBN.
16. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała wykrywającego do każdej studzienki.
17. Przykryć płytkę uszczelką foliową w celu ochrony kulek przed światłem i inkubować na wytrząsarce płytek w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem z prędkością 800 obr./min.
18. Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytowym na 1 minutę.
19. Trzymając płytkę na magnetycznym separatorze płytowym, odwróć płytkę, aby opróżnić studzienki, a następnie postukaj, aby wysuszyć grubą warstwę laboratoryjnych ręczników papierowych 3-4 razy.
    nuta: Alternatywnie można ręcznie zassać studzienki za pomocą pipety wielokanałowej lub użyć automatycznej myjki do płyt.
20. Umyj każdą studzienkę dwa razy, postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach 10-12.
    nuta: Usuń jak najwięcej buforu przed przejściem do następnego kroku, aby uniknąć potencjalnego rozcieńczenia reakcji.
21. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl buforu do każdego dołka i wstrząsaj przez 1 minutę na wytrząsarce płytkowej z prędkością 800 obr./min. Streptawidyna, koniugat R-fikoerytryny (SAPE).
22. Rozcieńczyć reporter SAPE do 4 μg/ml w buforze do oznaczania.
23. Dodać 50 μl rozcieńczonego SAPE do każdego dołka.
24. Przykryć płytkę uszczelką foliową w celu ochrony kulek i SAPE przed światłem i inkubować na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej przez 30 minut z wytrząsaniem z prędkością 800 obr./min.
25. Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytowym na 1 minutę.
26. Trzymając płytkę na magnetycznym separatorze płytowym, odwróć płytkę, aby opróżnić studzienki, a następnie postukaj, aby wysuszyć grubą warstwę laboratoryjnych ręczników papierowych 3-4 razy.
    UWAGA: Alternatywnie można ręcznie zassać studzienki za pomocą pipety wielokanałowej lub użyć automatycznej myjki do płyt
.
27. Umyj każdą studzienkę dwa razy, postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach 10-12.
28. Dodaj 100 μl PBS-TBN do każdego dołka i wstrząsaj przez 1 minutę na wytrząsarce płytkowej z prędkością 800 obr./min.
29. Przeanalizuj 50 μl każdej reakcji na analizatorze Luminex (zgodnie z instrukcją obsługi używanego analizatora), zbierając do analizy co najmniej 50 kulek na zestaw kulek. Poniżej znajduje się krótki opis xMAP INTELLIFLEX®.
    1. Wybierz menu rozwijane w lewym górnym rogu ekranu i przejdź do opcji Konfiguracja blachy.
    2. Wybierz opcję Uruchom blachę.
    3. Wybierz ikonę Wysuń, aby wysunąć nośnik płyty.
    4. Załaduj tabliczkę na nośnik płyty i wybierz ikonę Wycofaj, aby schować nośnik płyty.
    5. Wybierz ikonę Uruchom, aby uruchomić blachę.

Wyniki

Rysunek 1: Przebieg pracy wielopoziomowego testu immunologicznego typu sandwich. Do każdej studzienki dozuje się multipleksowaną mieszaninę mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami i dodaje się próbkę. Po inkubacji przez 1 godzinę reakcje przemywa się i dodaje biotynylowane przeciwciała wykrywające. Po 1-godzinnej inkubacji reakcje są ponownie przemywane i dodawany jest reporter SAPE....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrosfery MagPlex®	Luminex®	MC100xx-YY	Indywidualne numery katalogowe znajdują się na stronie internetowej (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order)
Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml	Eppendorf™	22431081	Białko LoBind®
0,1 M jednozasadowy fosforan sodu (NaH2PO4), pH 6,2	MiliporeSigma	Zobacz materiał S3139	Bufor aktywacji
Chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC)	Thermo Scientific™	Pierce™ 77149
N-hydroksysulfosukcynimid (Sulfo-NHS)	Thermo Scientific ™	Przekłucie™ 24510
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4	MiliporeSigma	Zobacz materiał P3813	Bufor sprzęgający
Zestaw do sprzęgania przeciwciał xMAP®	Luminex®	40-50016	Dostępny opcjonalny zestaw do sprzęgania mikrosferycznego.
Przeciwciało anty-Escherichia coli O157:H7	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0326	Poliklonalny, używany zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
Przeciwciało anty-Salmonella CSA-Plus	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0321	Poliklonalny, używany zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
Przeciwciało anty-Campylobacter spp.	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0324	Poliklonalny, używany zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
Przeciwciało anty-Listeria	SeraCare (Opieka Medyczna)	Nr kat. 5310-0319	Poliklonalne, specyficzne dla rodzaju, używane zarówno do wychwytywania, jak i wykrywania
PBS, pH 7,4 zawierający 0,02% Tween-20, 0,1% BSA, 0,05% azydku sodu (PBS–TBN)	MiliporeSigma	P3563 A7888 Zobacz materiał S8032	Można użyć do 1% BSA
Przeciwciało anty-Escherichia coli O157:H7	SeraCare (Opieka Medyczna)	5310-0326	Poliklonalny
(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna) (Pierce).	Thermo Scientific™	A39257
E. coli O157:H7	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0013	Zabity termicznie
Salmonella serotyp Typhimurium	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0002	Zabity termicznie
Campylobacter jejuni	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0011	Zabity termicznie
Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes)	SeraCare (Opieka Medyczna)	5370-0010	Zabity termicznie
Streptawidyna, koniugat R-fikoerytryny (SAPE)	Thermo Scientific™	Zobacz materiał S866

powiedział: powiedział: (wersja angielska)