Izolacja i trawienie białek neutrofilowych

Streszczenie

Ten film pokazuje izolację białka z neutrofili, które jest dalej przetwarzane i trawione na mniejsze peptydy. Peptydy te mogą być wykorzystane do przyszłych analiz.

Protokół

1. Pobieranie i liza komórek neutrofilowych

1. Zebrać zróżnicowane neutrofile komórki HL60 w probówce o pojemności 15 ml, odwirowując próbki o masie 400 x g przez 5 minut.
   nuta: Neutrofile powinny znajdować się w konfluencji 3,5 x 10⁵ komórek/ml po różnicowaniu. Zbierz około pięciu milionów komórek w celu całkowitej ekstrakcji proteomu.
2. Odrzucić supernatant i dodać 15 ml roztworu buforowanego fosforanem (PBS) do probówki.
3. Odwirować próbki o masie 400 x g przez 5 minut.
4. Powtórz kroki od 1.2 do 1.3.
   nuta: Próbki komórek można błyskawicznie zamrażać ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80°C po kroku 1.4, w zależności od ram czasowych eksperymentu.
5. Do każdej próbki dodać 300 μl zimnego 100 mM chlorowodorku Tris (hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) o pH 8,5 zawierającego tabletkę koktajlu inhibitorów proteinaz ().
6. Krótko przekręć próbki.
7. Dodać 1/10 objętości 20% SDS do końcowego stężenia 2% SDS.
8. Aby poddać lizie próbki komórek, sonduj próbki sonikowane w łaźni lodowej przez 30 sekund i 30 sekund przerwy przez pięć cykli przy 10% mocy.
9. Odwirować próbki z krótkim wirowaniem (maksymalna prędkość przez 5-10 sekund).
   nuta: Nie pozwól, aby szczątki ogniw uległy osadzaniu. Użyj krótkiego wirowania, aby zebrać spray ze ścianek tuby.
10. Przenieść próbki z probówki o pojemności 15 ml do probówki o pojemności 2 ml.
11. Dodać 1/10 objętości 1 M wywaru Ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 10 mM DTT.
12. Krótko przekręć próbki.
13. Inkubować próbki przez 10 minut z wytrząsaniem przy 800 obr./min w temperaturze 95°C.
14. Po 10 minutach schłodzić próbki do temperatury pokojowej.
    nuta: Próbki można umieszczać w lodzie, aby przyspieszyć proces chłodzenia.
15. Dodać 1/10 objętości 0,55 mM jodoacetamidu (IAA) do końcowego stężenia 55 mM IAA.
    nuta: Wykonaj krok 1.15 w ciemności, aby uniknąć wystawiania IAA na działanie światła.
16. Krótko przekręć próbki.
17. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.
18. Dodać 100% lodowatego acetonu o końcowym stężeniu 80% i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C przez noc.
    nuta: W razie potrzeby można przechowywać w temperaturze -20 °C do dwóch tygodni.

2. Trawienie białek neutrofilowych

1. Odwirować próbki z prędkością 13 500 obr./min w temperaturze 4°C przez 10 minut w celu wytrącenia osadów komórkowych.
2. Wyrzucić supernatant i przemyć granulki komórkowe 500 μl 80% lodowatego acetonu.
3. Odwirować próbki z prędkością 13 500 obr./min w temperaturze 4°C przez 10 minut i usunąć supernatant.
4. Powtórz kroki od 2.1 do 2.3.
5. Granulki suche na powietrzu.
6. Po wyschnięciu dodać 100 μl 8 M mocznika/40 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) do osadu komórkowego i sonikować wodą w łaźni wodnej o temperaturze 4°C przez 30 sekund z przerwami, przez 15 cykli w celu rozpuszczenia granulek białka.
7. Za pomocą testu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) tryptofanu (lub równoważnego) określa ilościowo stężenie białka zgodnie z instrukcjami producenta.
8. Dodać 300 μl wodorowęglanu amonu (ABC) w celu rozcieńczenia próbki do końcowego stężenia 2 M mocznika.
9. Aby strawić 50 μg białka, dodaj 1:50 trypsyny/LysC (stosunek enzymu do białka) do próbek na lodzie - wymieszaj próbki, delikatnie stukając.
10. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez noc, aby przeprowadzić trawienie.

Wyniki

Rysunek 1. Przebieg pracy komórek HL60 zróżnicowanych w neutrofile do profilowania proteomicznego opartego na spektrometrii mas. Niezróżnicowane i zróżnicowane (poprzez stymulację chemiczną DMSO) linie komórkowe HL60 hodowano, zbierano i przetwarzano w celu całkowitej ekstrakcji proteomu. Białka trawiono za pomocą trypsyny/LysC, a peptydy oczyszczano za pomocą końcówek C18 STAGE, a następnie wykrywa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tubka Falcon 15 ml	Firma VWR	Numer telefonu 470225-000
25 ml Leki serologiczne	Fisher Naukowy	14955235
Wodorowęglan amonu (ABC)	ThermoFisher Naukowy	A643-500
aceton	Sigma Aldrich	34850-1L
Zestaw testowy BSA	Firma VWR	CA62408-940
Wirówka 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (DTT)	ThermoFisher Naukowy	Czynnik R0861	Przygotuj 1 mln zapasów porcji naziemnej telewizji cyfrowej i przechowuj w temperaturze -20°C
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Naukowy	12483020	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Blok grzewczy
HEPESY	Sigma Aldrich	H3375	Przygotować porcje 8M mocznika/40 m HEPES, przechowywać w temperaturze -20 °C
Jodoacetamid (IAA)	Fisher Naukowy	AAA1471514	Przygotować 0,55 mln zapasów porcji IAA i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać ekspozycji na światło
L-glutamina	Fisher Naukowy	25030081	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Ciekły azot
Probówki do mikrowirówek LoBind	Eppendorf	13-698-794
Penicylina Streptomycyna, Amfoterycyna	Sigma Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Komórki HL60 zróżnicowane neutrofilami
Roztwór buforowany fosforanami (PBS)	Sklep biologiczny	PBS408	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Sonda soniczna	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 100-132-894
Tabletka z koktajlem inhibitorów proteazy ()	Sigma Aldrich	5892791001	Przechowywać w temperaturze 4°C
Silnik RPMI 1640	ThermoFisher Naukowy	11875093	Przechowywać w temperaturze 4°C
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	ThermoFisher Naukowy	J18220. Klasa A1	przygotować 2% roztwór SDS
Wirówka SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Kolby T75	ThermoFisher Naukowy	156499
Tris HCL pH 8,5	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-1	Przechowywać w temperaturze 4°C
Kąpiel ultradźwiękowa	Firma VWR	Numer katalogowy: 97043-960
mocznik	Sklep biologiczny	URE001.1

TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: