Izolacja i trawienie białek neutrofilowych

Streszczenie

Ten film pokazuje izolację białka z neutrofili, które jest dalej przetwarzane i trawione na mniejsze peptydy. Peptydy te mogą być wykorzystane do przyszłych analiz.

Protokół

1. Pobieranie i liza komórek neutrofilowych

1. Zebrać zróżnicowane neutrofile komórki HL60 w probówce o pojemności 15 ml, odwirowując próbki o masie 400 x g przez 5 minut.
   nuta: Neutrofile powinny znajdować się w konfluencji 3,5 x 10⁵ komórek/ml po różnicowaniu. Zbierz około pięciu milionów komórek w celu całkowitej ekstrakcji proteomu.
2. Odrzucić supernatant i dodać 15 ml roztworu buforowanego fosforanem (PBS) do probówki.
3. Odwirować próbki o masie 400 x g przez 5 minut.
4. Powtórz kroki od 1.2 do 1.3.
   nuta: Próbki komórek można błyskawic....

Wyniki

Rysunek 1. Przebieg pracy komórek HL60 zróżnicowanych w neutrofile do profilowania proteomicznego opartego na spektrometrii mas. Niezróżnicowane i zróżnicowane (poprzez stymulację chemiczną DMSO) linie komórkowe HL60 hodowano, zbierano i przetwarzano w celu całkowitej ekstrakcji proteomu. Białka trawiono za pomocą trypsyny/LysC, a peptydy oczyszczano za pomocą końcówek C18 STAGE, a następnie wykrywa.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tubka Falcon 15 ml	Firma VWR	Numer telefonu 470225-000
25 ml Leki serologiczne	Fisher Naukowy	14955235
Wodorowęglan amonu (ABC)	ThermoFisher Naukowy	A643-500
aceton	Sigma Aldrich	34850-1L
Zestaw testowy BSA	Firma VWR	CA62408-940
Wirówka 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitol (DTT)	ThermoFisher Naukowy	Czynnik R0861	Przygotuj 1 mln zapasów porcji naziemnej telewizji cyfrowej i przechowuj w temperaturze -20°C
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Naukowy	12483020	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Blok grzewczy
HEPESY	Sigma Aldrich	H3375	Przygotować porcje 8M mocznika/40 m HEPES, przechowywać w temperaturze -20 °C
Jodoacetamid (IAA)	Fisher Naukowy	AAA1471514	Przygotować 0,55 mln zapasów porcji IAA i przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać ekspozycji na światło
L-glutamina	Fisher Naukowy	25030081	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Ciekły azot
Probówki do mikrowirówek LoBind	Eppendorf	13-698-794
Penicylina Streptomycyna, Amfoterycyna	Sigma Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	Rozmrozić, przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20°C
Komórki HL60 zróżnicowane neutrofilami
Roztwór buforowany fosforanami (PBS)	Sklep biologiczny	PBS408	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Sonda soniczna	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 100-132-894
Tabletka z koktajlem inhibitorów proteazy ()	Sigma Aldrich	5892791001	Przechowywać w temperaturze 4°C
Silnik RPMI 1640	ThermoFisher Naukowy	11875093	Przechowywać w temperaturze 4°C
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	ThermoFisher Naukowy	J18220. Klasa A1	przygotować 2% roztwór SDS
Wirówka SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Kolby T75	ThermoFisher Naukowy	156499
Tris HCL pH 8,5	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-1	Przechowywać w temperaturze 4°C
Kąpiel ultradźwiękowa	Firma VWR	Numer katalogowy: 97043-960
mocznik	Sklep biologiczny	URE001.1

TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: