$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Test neutralizacji oparty na pseudotypach
UWAGA: pMN to hamowanie transdukcji za pośrednictwem wirusa pseudotypu (PV) za pośrednictwem próbek ludzkiej surowicy rekonwalescencyjnej, które zawierają przeciwciała skierowane przeciwko kolcowi SARS-CoV-2.
- Na 96-dołkowej białej płytce za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) do rzędów od B do H, kolumny 1-12.
- Dodać 5 μl surowic rekonwalescencyjnych do studzienek w rzędzie A, kolumny 2-10, w całkowitej objętości 100 μl DMEM/10% FBS/1% P/S. Dodać znaną ilość (np. 5 μl) dodatnich (kalibert NIBSC 20/162, pula HICC-2 lub pula HICC 3) i ujemnych surowic odpornościowych (surowice pacjenta pobrane przed 2019 r.) do studzienek A11 i A12 jako kontrole.
- Usunąć 50 μl z dołków rzędu A i wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia we wszystkich studzienkach znajdujących się poniżej.
- Na każdym etapie rozcieńczania należy mieszać pipetą wielokanałową 5-10 razy, pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie powstawały pęcherzyki powietrza.
- Po zakończeniu seryjnego rozcieńczania ostatnie 50 μl z ostatniego dołka każdej kolumny należy wyrzucić.
UWAGA: W tym momencie każda studzienka powinna zawierać 50 μl mieszanego DMEM i seryjne rozcieńczenia surowicy pacjenta lub surowic kontrolnych.
- Odwiruj płytkę przez 1 minutę przy 500 obr./min, aby upewnić się, że na ściankach studni nie pozostał żaden płyn
.
- Korzystając z danych uzyskanych za pomocą miareczkowania pseudotypowego, oblicz ilość DMEM potrzebną do rozcieńczenia PV SARS-CoV-2 w celu uzyskania 5 x 106 RLU w 50 μl, o całkowitej objętości 5 ml.
- Wymieszać ten rozcieńczony roztwór fotowoltaiczny w misce na pipety za pomocą pipety wielokanałowej i podsycić 50 μl do każdego dołka na płytce, z wyjątkiem studzienek A6-A12 (kontrola tylko z ogniwem). A1-A6 będzie służyć jako sterowanie wyłącznie fotowoltaiczne.
- Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 500 obr./min, aby upewnić się, że na ściankach studni nie pozostał żaden wirus.
- Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 5% dwutlenku węgla (CO2) w temperaturze 37 °C, dając surowicy czas na związanie glikoproteiny SARS-CoV-2.
- Przygotować płytkę z komórkami docelowymi HEK 293T/17 transfekowanymi 24 godziny wcześniej plazmidem ekspresyjnym enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) i plazmidami transbłonowej proteazy serynowej 2 (TMPRSS2).
- Usuń pożywkę hodowlaną z płytki.
- Umyj płytkę dwukrotnie 2 ml PBS po jednej stronie naczynia, aby uniknąć oderwania się komórek i wyrzucenia.
- Dodać 2 ml trypsyny do płytki i umieścić płytkę w inkubatorze, aż komórki się oderwą.
- Po odłączeniu komórek dodaj 6 ml DMEM/10% FBS/1% penicyliny/streptomycyny do płytki, aby ugasić aktywność trypsyny i delikatnie zawiesić komórki.
- Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek TC20TM lub szkiełka z komorą liczącą i dodaj 1 x 104 komórki w łącznej objętości 50 μl do każdego dołka.
- Inkubować płytkę przez 48–72 godzin, w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Odczytać płytkę za pomocą systemu do oznaczania lucyferazy Bright GloTM na luminometrze mikropłytki GloMax® Navigator, usuwając pożywkę hodowlaną ze wszystkich studzienek i dodając 25 μl mieszaniny 1:1 odczynnika do oznaczania lucyferazy PBS: Bright GloTM
.
- Na podstawie surowych danych dostarczonych przez luminometr oblicz miana przeciwciał neutralizujących o połowie maksymalnego stężenia hamującego (IC50) przy użyciu ustalonych protokołów. Wartości IC50 poniżej rozcieńczenia 1:40 są uważane za ujemne. Dane mogą być alternatywnie oceniane za pomocą funkcji AutoPlate.