Ocena funkcjonalnych przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2

Streszczenie

Ten film prezentuje test neutralizacji mierzący skuteczność surowicy w neutralizacji wirusów SARS-CoV-2. Obejmuje wirusy pseudotypowane, rozcieńczenie surowicy i kwantyfikację na podstawie luminescencji, ujawniającą miano neutralizacji.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Test neutralizacji oparty na pseudotypach

UWAGA: pMN to hamowanie transdukcji za pośrednictwem wirusa pseudotypu (PV) za pośrednictwem próbek ludzkiej surowicy rekonwalescencyjnej, które zawierają przeciwciała skierowane przeciwko kolcowi SARS-CoV-2.

1. Na 96-dołkowej białej płytce za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) do rzędów od B do H, kolumny 1-12.
2. Dodać 5 μl surowic rekonwalescencyjnych do studzienek w rzędzie A, kolumny 2-10, w całkowitej objętości 100 μl DMEM/10% FBS/1% P/S. Dodać znaną ilość (np. 5 μl) dodatnich (kalibert NIBSC 20/162, pula HICC-2 lub pula HICC 3) i ujemnych surowic odpornościowych (surowice pacjenta pobrane przed 2019 r.) do studzienek A11 i A12 jako kontrole.
3. Usunąć 50 μl z dołków rzędu A i wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia we wszystkich studzienkach znajdujących się poniżej.
4. Na każdym etapie rozcieńczania należy mieszać pipetą wielokanałową 5-10 razy, pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie powstawały pęcherzyki powietrza.
5. Po zakończeniu seryjnego rozcieńczania ostatnie 50 μl z ostatniego dołka każdej kolumny należy wyrzucić.
   UWAGA: W tym momencie każda studzienka powinna zawierać 50 μl mieszanego DMEM i seryjne rozcieńczenia surowicy pacjenta lub surowic kontrolnych.
6. Odwiruj płytkę przez 1 minutę przy 500 obr./min, aby upewnić się, że na ściankach studni nie pozostał żaden płyn
.
7. Korzystając z danych uzyskanych za pomocą miareczkowania pseudotypowego, oblicz ilość DMEM potrzebną do rozcieńczenia PV SARS-CoV-2 w celu uzyskania 5 x 10⁶ RLU w 50 μl, o całkowitej objętości 5 ml.
8. Wymieszać ten rozcieńczony roztwór fotowoltaiczny w misce na pipety za pomocą pipety wielokanałowej i podsycić 50 μl do każdego dołka na płytce, z wyjątkiem studzienek A6-A12 (kontrola tylko z ogniwem). A1-A6 będzie służyć jako sterowanie wyłącznie fotowoltaiczne.
9. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 500 obr./min, aby upewnić się, że na ściankach studni nie pozostał żaden wirus.
10. Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 5% dwutlenku węgla (CO₂) w temperaturze 37 °C, dając surowicy czas na związanie glikoproteiny SARS-CoV-2.
11. Przygotować płytkę z komórkami docelowymi HEK 293T/17 transfekowanymi 24 godziny wcześniej plazmidem ekspresyjnym enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) i plazmidami transbłonowej proteazy serynowej 2 (TMPRSS2).
    1. Usuń pożywkę hodowlaną z płytki.
    2. Umyj płytkę dwukrotnie 2 ml PBS po jednej stronie naczynia, aby uniknąć oderwania się komórek i wyrzucenia.
    3. Dodać 2 ml trypsyny do płytki i umieścić płytkę w inkubatorze, aż komórki się oderwą.
    4. Po odłączeniu komórek dodaj 6 ml DMEM/10% FBS/1% penicyliny/streptomycyny do płytki, aby ugasić aktywność trypsyny i delikatnie zawiesić komórki.
    5. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek TC20^TM lub szkiełka z komorą liczącą i dodaj 1 x 10⁴ komórki w łącznej objętości 50 μl do każdego dołka.
12. Inkubować płytkę przez 48–72 godzin, w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
13. Odczytać płytkę za pomocą systemu do oznaczania lucyferazy Bright Glo^TM na luminometrze mikropłytki GloMax® Navigator, usuwając pożywkę hodowlaną ze wszystkich studzienek i dodając 25 μl mieszaniny 1:1 odczynnika do oznaczania lucyferazy PBS: Bright Glo^TM
.
14. Na podstawie surowych danych dostarczonych przez luminometr oblicz miana przeciwciał neutralizujących o połowie maksymalnego stężenia hamującego (IC50) przy użyciu ustalonych protokołów. Wartości IC50 poniżej rozcieńczenia 1:40 są uważane za ujemne. Dane mogą być alternatywnie oceniane za pomocą funkcji AutoPlate.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Końcówki do pipet MultiGuard Barrier 1-20 μl	Sorenson BioScience	30550T
Końcówki do pipet MultiGuard Barrier 1-200 μl	Sorenson BioScience	30550T
Naczynie do hodowli komórkowych NuncTM Delta poddane obróbce powierzchniowej (sterylne naczynia 10 cm)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 150350
Miski na pipety (50 ml)	rodzajowy
Biała płytka 96-dołkowa	Thermo FisherNaukowy	136101
Ogniwa HEK 293T/17	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-11268
Plazmid ekspresji enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) receptora wejścia do komórki gospodarza: pCDNA3.1 + -ACE2			Simmons 2004
Białko Coronavirus Spike (S) transbłonowe stężenie proteazy serynowej 2 (TMPRSS2) ekspresji plazmidu: pCAGGS-TMPRSS2			Bertram 2010
Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 4,5 g/l glukozy, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S)	Pan-Biotechnologia	P04-04510 P40-37500 P06-07100
Odczynnik do transfekcji FuGENE® HD, 1ml	Preparat Promega	E2311
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Pan-Biotechnologia	P10-040100
Przeciwciało kontroli pozytywnej (odczynnik badawczy do anty-SARS-CoV-2 Ab), które może neutralizować wirusa SARS-CoV-2 PV (NIBSC, kod: 20/162, dostępny na całym świecie lub HICC-pool 2/HICC pool 3)
COVID-19 ludzkie osocze ozdrowieńców do testów
System oznaczania lucyferazy Bright Glo	Preparat Promega	E2650

powiedział: powiedział: powiedział: