Pomiar poziomu immunoglobuliny G w stosunku do testowanej szczepionki w surowicy myszy

Streszczenie

Źródło: Zeng, X. et al., Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsji przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA).J. Vis. Exp.(2023)

Ten film demonstruje metodę oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwciał na nową szczepionkę z adiuwantem nanoemulsyjnym u wstępnie zaszczepionych myszy. Immunizacja wzmacnia odpowiedź przeciwciał, co potwierdza się przez określenie miana przeciwciał IgG.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie białka antygenu MRSA HI

1. Uzyskać klony czynnika determinującego powierzchnię jonów Fe B (IsdB) i zmutowanych α-hemolizyny (Hla) ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów), przeprowadzić amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu amplifikacji genów IsdB i Hla oraz podwiązać ich produkty do plazmidu PGEX-6P-2 (uzyskanego komercyjnie; patrz tabela materiałów). Ekran z wektorem Xl/niebieski szczep Escherichia coli.
2. Przekształć dodatni klon w kompetentne komórki E. coli BL21 (patrz tabela materiałów) i amplifikuj za pomocą hodowli rekinów.
3. Sprymować antygen i wyizolować po indukcji za pomocą zestawów do izolacji izopropylo-β-D-1-merkaptogalaktopiranozydu i chromatografii multimodalnej (MMC) (patrz tabela materiałów).
4. Scharakteryzuj białko antygenowe i oczyść je za pomocą w pełni zautomatyzowanego oczyszczacza.
   1. Białka znakowane S-transferazą gutationu (GST) oczyszczają się z powinowactwa z oczyszczonych lizatów przy użyciu dostępnej na rynku żywicy chromatograficznej powinowactwa (patrz tabela materiałów).
   2. Oczyścić rekombinowane białka za pomocą izopropylo-β-D-1-merkaptogalaktopiranozydu i chromatografii multimodalnej (MMC).
   3. Usuń endotoksynę metodą separacji faz Triton X-114. Krótko mieszać 1% Triton X-114 z rekombinowanym eluatem białkowym w temperaturze 0 °C przez 5 minut, aby uzyskać jednorodny roztwór, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby umożliwić powstanie dwóch faz.
5. Użyj metody badania endotoksyn bakteryjnych z zestawami żółwi (patrz tabela materiałów), aby wykryć stężenie endotoksyny. Endotoksyna dla antygenu białkowego wynosi 0,06 EU/μg, czyli mniej niż norma międzynarodowa (1,5 EU/μg).
   1. Wykonaj test zakłóceń, aby wyeliminować możliwy wpływ badanego produktu na wykrywanie endotoksyn.
      nuta: Zgodnie z Załącznikiem 2020 do Farmakopei Chińskiej zawartość endotoksyn powinna być mniejsza niż 5 EU/dawkę. Czułość lizatu limulusa (λ0,25 EU/ml) i maksymalny efektywny współczynnik rozcieńczenia wynoszący 33,3 obliczono na podstawie maksymalnego ważnego rozcieńczenia, MVD = cL/λ, gdzie L jest wartością graniczną endotoksyny bakteryjnej dla badanego artykułu, c jest stężeniem roztworu badanego artykułu, a gdy L jest wyrażone w EU/m, c jest równe 1,0 mg/ml. λ jest znakowaną czułością (EU/ml) odczynnika do kraba podkowiastego w metodzie żelowej.
6. Rekombinuj antygen (48 kDa, oznaczony przez 12% elektroforezę w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu [SDS-PAGE]) w stężeniu 1,5 mg/ml w sterylnej wodzie bez endotoksyny lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (metoda dichloranu sodu).
   UWAGA: Czas szczytu białka wynosił 13,843 min, czystość wynosiła 99,4% (metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej), a białko przechowywano w temperaturze -70 °C. Jako matrycę PCR użyto genomowego DNA wyekstrahowanego ze szczepu S. aureus MRSA252 (patrz Tabela materiałów). Gen IsdB amplifikowano przy użyciu startera 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
   C-39 i podkład odwrotny 59-TTTTCCTTTTGCGG
   CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39.
   Gen Hla amplifikowano przy użyciu startera przedniego PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) i startera odwrotnego PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTCATTTCTTC).

2. Przygotowanie szczepionki nanoemulsyjnej

1. Zgodnie ze stosunkiem masowym 1:6:3 (w/w), dodać kolejno trzy rodzaje substancji pomocniczych (mirystynian izopropylu, polioksyetylenowy olej rycynowy i glikol propylenowy; patrz Tabela materiałów) do roztworu białka antygenu HI (10 mg / ml) i dobrze wymieszać. Następnie stopniowo dodawać wysterylizowaną czystą wodę, aż do uzyskania końcowej objętości 10 ml i mieszać przy 500 obr./min i 25 °C przez około 20 minut.
   nuta: Nanoemulsja przygotowana w tym protokole ma objętość 10 ml, a masy trzech substancji pomocniczych wynoszą odpowiednio 0,34 g, 2 g i 1 g. Roztwór białkowy jest tutaj roztworem roboczym, o stężeniu 10 razy większym niż roztwór końcowy.
2. Przygotować szczepionkę z adiuwantem nanoemulsyjnym (1 mg/ml białka) metodami emulgowania o niskiej energii, aby uzyskać klarowny i przezroczysty płynny roztwór.
   nuta: Ślepą próbę nanoemulsji (BNE) przygotowano podobnymi metodami, z tą różnicą, że wodę zastąpiono HI. Typowa metoda emulgowania polega na podgrzaniu fazy zewnętrznej i wewnętrznej do około 80 °C w celu emulgacji, a następnie na ich stopniowym mieszaniu i schładzaniu. W tym procesie zużywa się dużą ilość energii, a na końcu uzyskuje się emulsję.

3. Charakterystyka fizyczna i stabilność szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym

1. Wielkość cząstek, potencjał zeta i charakterystyka wskaźnika dyspersji polimeru (PDI).
   1. Przygotować 100 μl szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym i rozcieńczyć 50-krotnie wodą do wstrzykiwań. Dodać 2 ml próbki do wykrycia.
   2. Obserwuj wielkości cząstek, potencjał zeta i PDI w temperaturze 25 °C za pomocą Nano Zetasizera (ZS; patrz Tabela Materiałów).
2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
   1. Rozcieńczyć 10 μl szczepionki nanoemulsyjnej 50-krotnie wodą, umieścić na pokrytej węglem siatce miedzianej o oczkach 100 i zabarwić 1% kwasem fosfowolframowym (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Usunąć nadmiar roztworu kwasu fosfatungstycznego za pomocą bibuły filtracyjnej.
   3. Obserwować morfologię pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (patrz tabela materiałów). Zbadaj, czy gotowe produkty są prawie stabilne i okrągłe w polu widzenia mikroskopu elektronowego i czy wykazują dobrą dyspersję.
3. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
   1. Rozcieńczyć 10 μl szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym 50-krotnie wodą, upuść 10 μl wstępnie rozcieńczonych próbek na płytkę krzemową i umieść w inkubatorze sterowanym termostatem o temperaturze 37 °C na 24 godziny.
   2. Rozpylaj przygotowaną platynę na silikon przez 40 s i ostudź do temperatury pokojowej.
   3. Obserwować właściwości morfologiczne przygotowanych próbek pod skaningowym mikroskopem elektronowym o wysokiej rozdzielczości (patrz tabela materiałów). Określ, czy próbki są prawie stabilne, kuliste i dobrze rozproszone w polu widzenia pod mikroskopem elektronowym.
4. Stabilność morfologiczna
   1. Umieścić 1 ml próbek szczepionki nanoemulsyjnej w probówkach do mikrowirówek i ocenić stabilność świeżych próbek przez wirowanie przez 30 minut przy 13 000 x g w temperaturze pokojowej (25 ° C).
   2. Obserwować wygląd tych świeżych próbek, a następnie przeprowadzić badanie stabilności termodynamicznej w sześciu cyklach temperaturowych (jeden cykl: przechowywać w temperaturze 4 °C przez 48 godzin, w temperaturze 25 °C przez 48 godzin i w temperaturze 37 °C przez 48 godzin).
   3. Po odwirowaniu odstawić próbki na 15 minut w celu ustalenia, czy występuje efekt Tyndalla (czy próbka jest przezroczysta i przezroczysta w świetle) i czy nastąpiła deemulgacja (wykazana przez klarowne rozwarstwienie po demulgacji).
5. SDS-PAGE i western blot
   1. Wstrząsnąć próbkami, wymieszać roztwór 0,6 ml bezwzględnego etanolu i 0,3 ml szczepionki i odwirować (13 000 x g, 30 min w temperaturze pokojowej, 25 °C).
   2. Przenieść sklarowanie osadu roztworu do czystej probówki i rozpuścić osad w 0,3 ml wody. Otrzymać roztwory sklarowanego osadu i osadu (zarówno ślepą próbę nanoemulsji, jak i szczepionki) po potraktowaniu absolutnym etanolem i roztworem wody destylowanej i przeprowadzić to samo 50-krotne rozcieńczenie.
   3. Wymieszać 2,5 ml żelu rozdzielającego A i 2,5 ml żelu rozdzielającego B (patrz tabela materiałów), dodać 50 μl 10% nadsiarczanu amonu i szybko umieścić roztwór w szklanej płytce za pomocą pipety. Wymieszaj 1 ml skoncentrowanego żelu A i 1 ml zagęszczonego żelu B, dodaj 20 μl 10% nadsiarczanu amonu do szklanej płytki, włóż grzebień o odpowiedniej wielkości i poczekaj na zestalenie.
   4. Do rozcieńczonej próbki otrzymanej w kroku 3.5.2 dodać łącznie 5 μl 5-krotnego roztworu buforowego obciążającego białko i gotować próbkę przez 5 minut.
   5. Dodać 10 μl podgrzanego białka do odpowiedniego dołka i dodać 5 μl markera białkowego do dołka markerowego.
   6. Podłącz elektrodę, włącz miernik elektroforezy (patrz Tabela materiałów) i ustaw napięcie na 300 V. Wyłącz zasilanie, gdy elektroforeza osiągnie 1 cm od spodu gumy PAGE.
   7. Usuń żel i spłucz wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O). Dodaj jasnoniebieski roztwór barwiący Coomassie G-250 (patrz tabela materiałów) przez 10 minut. Wylej roztwór barwiący i dwukrotnie spłucz żel roztworem i dostępnym w handlu roztworem odbarwiającym i podgrzewaj żel w kuchence mikrofalowej przez 1 minutę. Wstrząsaj żelem przez 10 minut i kilkakrotnie zmieniaj roztwór odbarwiający, aż tło żelu będzie czyste. Następnie należy wykonać obrazowanie żelu (patrz Tabela materiałów).
      nuta: Western blot został wstępnie przetworzony, jak opisano w krokach 3.5.1-3.5.6.
   8. Namocz trzy bloki bibuły filtracyjnej buforem transferowym do elektroforezy. Namocz membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu przez 30 s i przenieś za pomocą półsuchego żelowego przyrządu do przenoszenia (dwie warstwy bibuły filtracyjnej, membrana PVDF, żel do elektroforezy i jedna warstwa bibuły filtracyjnej). Użyj napięcia 23 V, aby przenieść membranę przez 23 minuty.
   9. Usuń membranę PVDF i po przeniesieniu przemyj ją jednorazowo buforowanym roztworem soli fizjologicznej 20 (TBST).
   10. Umieścić membranę PVDF w roztworze uszczelniającym (5% odtłuszczony roztwór mleka w proszku) i uszczelnić przez noc w temperaturze 4 °C.
   11. Usuń membranę PVDF i umyj ją trzykrotnie TBST lub po 10 minut.
   12. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (od uodpornionych myszy z dodatnią surowicą). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów), które ma być badane, 500-krotnie (100-krotnie) za pomocą TBST. Umieścić zablokowaną membranę PVDF w przeciwciałie pierwszorzędowym i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   13. Usuń membranę PVDF i umyj ją trzykrotnie TBST przez 10 minut każde.
   14. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (patrz tabela materiałów). Rozcieńczyć kozie przeciwciało wtórne przeciwko mysim przeciwciałom przeciw mysim znakowane fosfatazą alkaliczną (AP) 5,000 razy za pomocą TBST. Umieścić membranę PVDF w przeciwciałie drugorzędowym i inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
   15. Usuń membranę PVDF i przemyj ją czterokrotnie TBST przez 10 minut każde.
   16. Zanurzyć membrany PVDF w mieszaninie (tylko tyle, aby namoczyć membranę) substratu AP nitro niebieskiego tetrazolu (NBT) i BCIP (sól 5-bromo-4-chloro-3'-indolilofosforanu p-toluidyny) (patrz tabela materiałów) w celu barwienia. Pozytywny wynik to purple.
       UWAGA: Wyniki muszą być przezroczystym fioletowym pasmem, a pasek próbki i masa cząsteczkowa antygenu powinny znajdować się w tej samej oznakowanej pozycji.

4. Ocena odpowiedzi immunologicznej przeciwciał na tę szczepionkę po podaniu domięśniowym

UWAGA: Myszy zostały uodpornione przez domięśniowe wstrzyknięcie szczepionki nanoemulsyjnej zgodnie z opublikowanym raportem. Myszom podawano PBS jako kontrolę negatywną. Po 1 tygodniu od zakończenia trzech szczepień pobrano surowicę od myszy. Poziomy IgG w surowicy i podklasy IgG1, IgG2a i IgG2b oznaczono ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

1. Otoczka antygenowa: Rozcieńczyć antygen białkowy HI do 10 μg/ml roztworem powlekającym i dodać do płytki ELISA w stężeniu 100 μl/basenik. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   nuta: Roztwór powlekający przygotowuje się przez rozpuszczenie 1,6 g bezwodnego węglanu sodu i 2,9 g wodorowęglanu sodu w 1 l wody dejonizowanej.
2. Uszczelnianie: Umyj płytkę (trzy cykle, każdy cykl 300 μL). Dodać 300 μl roztworu uszczelniającego do każdej studzienki i uszczelnić studzienki na 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   nuta: Roztwór uszczelniający przygotowuje się przez dodanie Tween-20 i albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do PBS. Zawartość BSA w roztworze PBST wynosi 1%.
3. Rozcieńczenie surowicy: Rozcieńczyć próbkę surowicy myszy 100 razy PBST (pobrać 3 μl surowicy i dodać ją do 297 μl PBST i wirować) i użyć 100 μl dla każdej próbki surowicy. Rozcieńczyć dodatnią surowicę i ujemną surowicę kontrolną 100 razy PBST, dodając 4 μl do 396 μl PBST, a następnie mieszając przez wirowanie.
4. Rozcieńczenie o podwójnym stosunku: Dodać 200 μl wyżej rozcieńczonej surowicy doświadczalnej do pierwszego rzędu powlekanej płytki ELISA i dodać 100 μl PBST do wszystkich studzienek z wyjątkiem pierwszego i^dwunastego rzędu. Wykonać rozcieńczenie 1:2 kolejno od pierwszego rzędu: ustawić pipetę na 100 μl, przenieść 100 μl z pierwszego rzędu do drugiego rzędu i wymieszać pipetą 10 razy.
5. Rozcieńczyć surowicę do wiersza 11 w różnych proporcjach i wylać 100 μl płynu.
6. Dodać rozcieńczoną ujemną i dodatnią surowicę do odpowiednich studzienek w wierszu 12 zgodnie z szablonem próbki (patrz tabela 1) -100 μl/basenik.
7. Uszczelnić płytki ELISA folią spożywczą i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
8. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim IgG-HRP (patrz tabela materiałów) PBST w stosunku 1:10 000.
9. Umyj płytkę (trzy cykle, każdy cykl 300 μL). Następnie dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
10. Barwienie i zakończenie: Umyć płytkę (pięć cykli, każdy cykl 300 μL). Dodać roztwór barwiący 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) (100 μl; patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Umieścić płytki w temperaturze 37 °C przez 10 minut z dala od światła, a następnie natychmiast zakończyć reakcję za pomocą 50 μl 2 M H₂SO₄.
11. Wykryj wartość gęstości optycznej (OD₄₅₀) za pomocą markera enzymatycznego (odczytaj wartość OD₄₅₀ w ciągu 15 minut po zakończeniu).

Tabela 1: Sekwencja impulsowa ELISA i szablon rozcieńczenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5424-Mała wirówka szybkoobrotowaFA-45-24-11	Eppendorf, Niemcy	5424000495
Płytki 96-dołkowe	Corning Incorporated, Stany Zjednoczone	CLS3922
AFM Dimension FastScan	BRUKER, Niemcy	zero
Myszy Balb/c	Pekin HFK Bioscience Co., Ltd.
Protokół BCIP/NBT	Firma zajmująca się rozwojem biotechnologii Fuzhou Maixin, Chiny	Protokół BCIP/NBT
Czytnik mikropłytek Bio-Rad 6.0	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, Stany Zjednoczone	zero
BL21 Właściwa komórka	Merck millipore, Niemcy	Zobacz materiał 70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał B2064-100G
Wirówka 5810 R	Eppendorf, Niemcy	5811000398
Coomassie jasnoniebieski roztwór barwiący G-250	MIKX, Chiny	DB236
Roztwór do odbarwiania	BOSTER, Chiny	Zobacz materiał AR0163-2
Kultywator stojący z ogrzewaniem elektrycznym HH-B11-420	Fabryka urządzeń medycznych Yuejin w Szanghaju, Chiny	zero
Aparatura do elektroforezy	Fabryka instrumentów Beijing Liuyi, Chiny	DYCZ-25D
Obraz żelu	Tanon, Stany Zjednoczone Ameryki	zero
Żywica glutationowo-sefarozowa GST	Mei5bio, Chiny	żywica do chromatografii powinowactwa
H2SO4	Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, Chiny	Nr kat. 7664-93-9
Białko rekombinowane HI	Trzeci Wojskowy Uniwersytet Medyczny, Chiny	Numer katalogowy: 110-27-0
HRP -Kozia IgG Przeciw Myszom	Biodragon, Chiny	BF03001
HRP- Koza anty-mysia IgG1	Biodragon, Chiny	BF03002R
HRP- Koza anty-mysia IgG2a	Biodragon, Chiny	BF03003R
HRP- Koza anty-mysia IgG2b	Biodragon, Chiny	BF03004R
Pętla inokulacji	Haimen Feiyue Co., LTD, Chiny	YR-JZH-1UL
Klony IsdB i Hla	Shanghai Jereh Biotechnology Co, Chiny	zero
Izopropylowa gałka muszkatołowa (adiuwant farmaceutyczny)	SEPPIC, Francja	zero
izopropylo-β-D-1-merkaptogalaktopiranozyd	fdbio, Chiny	FD3278-1
LB pożywka bulionowa	Pekin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Chiny	02-136
Wirówka z chłodzeniem niskotemperaturowym	Eppendorf, Niemcy	zero
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., Wielka Brytania	zero
Myjka do mikropłyt 405 LSRS	Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,Stany Zjednoczone	zero
Kompaktowy przyrząd do przenoszenia folii Mini-TBC	BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, Chiny	1658030
Pakowanie MMC	TOSOH (SZANGHAJ) CO., LTD	Numer katalogowy: 22818
MRSA252	Stany Zjednoczone, ATCC	zero
Spektrofotometr ultrafioletowy Nanodrop	Thermo Scientific, Stany Zjednoczone	zero
Nowy zestaw żelu do elektroforezy białek FlashTM Protein any KD PAGE	DAKEWE, Chińska Republika Ludowa	8012011
Pbs	biosharp, Chińska Republika Ludowa	zero
PCR, Wzmacniacz	Termocykler, Stany Zjednoczone	zero
rekombinowany plazmid genu docelowego pGEX	Shanghai Jereh Biotechnology Co, Chiny	Zobacz materiał B3528G
Kwas fosfowolframowy	G-CLONE, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał CS1231-25g
pipeta	Eppendorf, Niemcy	3120000844
Polioksyetylowany olej rycynowy (adiuwant farmaceutyczny)	Aladyn, Chińska Republika Ludowa	K400327-1kg
Przeciwciało pierwszorzędowe	Laboratoryjne domowej roboty: z zaszczepionych myszy z dodatnimi surowicami	zero	Szczegółowe informacje można znaleźć w odnośniku 11
Glikol propylenowy (adiuwant farmaceutyczny)	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P4347-500ML
Marker białkowy	Thermo Scientufuc, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 26616
Membrana transferowa PVDF	Invitrogen, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 88518
Skaningowy mikroskop elektronowy	JEOL, Japonia	Zobacz materiał JSM-IT800
Talos L120C TEM	Thermo Fisher, Stany Zjednoczone	zero
Rozwiązanie kolorystyczne TMB	TIAN GEN, Chiny	PA107-01
Zestawy żółwi	Xiamen Bioendo Technology Co., LTD	ES80545
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Macklin, Chińska Republika Ludowa	9005-64-5

powiedział: powiedział: