1. Ocena rozszczepienia lub degradacji białek w wirusie grypy A, komórkach zakażonych IAV przez kaspazy
- Wysiew 3 x 105 komórek Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) lub A549 na studzienkę w 12-dołkowej płytce do hodowli komórek.
nuta: Jeśli używasz komórek MDCK, upewnij się, że przeciwciało przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania rozpoznaje swój gatunek psów.
- Zasiej studzienki parami, tj. parą kontrolną - jedną studzienką dla niezakażonej próbki makiety i jedną dla próbki zainfekowanej - makietą, parą testową - jedną studzienką dla próbki niezakażonego inhibitora A i jedną dla próbki zakażonego inhibitora A. Zwiększaj liczbę par z każdym dodatkowym inhibitorem.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc.
- Następnego dnia należy zainfekować komórki wirusem IAV (podtyp H1N1 lub inny podtyp).
- W tym celu należy przygotować inokulum wirusa, rozcieńczając zapas wirusa w 400 μl minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) bez surowicy (patrz Tabela Materiałów) przy wielokrotności infekcji (MOI) 0,5-3,0 jednostek tworzących płytkę miażdżycową (pfu)/komórkę (współczynnik podwojenia liczby komórek przy obliczaniu MOI).
nuta: W celu zakażenia komórek MDCK należy uzupełnić inokulum wirusa trypsyną tosyl-fenyloalanylochlorometylu (TPCK)-trypsyną w końcowym stężeniu 1 μg/ml.
- Usunąć starą pożywkę hodowlaną z komórek (krok 1.3) i umyć komórki 1 ml/dołek MEM bez surowicy 2x.
- Dodać 400 μl inokulum wirusa (etap 1.4.1) do komórek i inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze 35 °C w atmosferze 5% dwutlenku węgla (CO2 ).
- W międzyczasie rozcieńczyć inhibitor kaspazy (np. Z-DEVD-FMK), inhibitor lizosomów (np. chlorek amonu, NH4Cl) lub inhibitor proteasomu (np. MG132) (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia odpowiednio 40 μM, 20 mM lub 10 μM w MEM bez surowicy (patrz tabela materiałów). Te dwa ostatnie inhibitory służą jako kontrola. Rozcieńczyć równą objętość rozpuszczalnika (jeżeli jest inny niż woda) użytego do rozpuszczenia jednego z inhibitorów w podłożu niezawierającym surowicy jako makietę.
- Usuń inokulum wirusa i umyj komórki jak w kroku 1.5 (1x).
- Dodać do komórek bezsurowicowy MEM o stężeniu 1 ml / studzienkę, próbowany lub uzupełniony inhibitorem i inkubować komórki jak w kroku 1.6. Ten punkt czasowy jest uważany za infekcję po 0 godzinach.
- Po 24 godzinach zbierz komórki, zeskrobując je tłokiem strzykawki o pojemności 1 ml (gumowa strona) i przenieś do probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować probówkę o sile 12 000 x g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant za pomocą pipety.
nuta: Ten supernatant może zostać odrzucony lub użyty do testu płytki nazębnej w celu zmierzenia miana uwolnionego potomstwa wirusa.
- Przepłukać osad komórkowy 250 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez ponowne odwirowanie, jak w kroku 1.11.
- Usuń supernatant i poddaj komórki lizie, dodając 80-100 μl buforu do lizy komórek (50 mM chlorowodorku Tris (hydroksymetyloaminometanu (THAM) (Tris-HCl), pH 7,4, 150 mM chlorku sodu (NaCl), 0,5% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,5% deoksycholanu sodu, 1% Triton X-100 i 1x koktajl inhibitorów proteazy, patrz Tabela materiałów) i wirowanie.
- Podgrzewać probówkę w temperaturze 98 °C przez 10 minut, aby całkowicie uległa lizie i przygotować całkowity lizat komórkowy. Przechowywać lizaty w temperaturze 4 °C do wykonania kroków 1.15-1.17 następnego dnia, ale w celu uzyskania najlepszych wyników należy zakończyć te kroki tego samego dnia.
- Oszacuj ilość białka w każdej próbce za pomocą zestawu do oznaczania kwasem bicynchoninowym (BCA) (patrz tabela materiałów).
- Rozpuść równe ilości białka z niezakażonych i zakażonych próbek za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE) wraz z markerami masy cząsteczkowej.
- Przenieść białko do membrany z nitrocelulozy lub polifluorku winylidenu (PVDF) (patrz tabela materiałów).
nuta: Membrana PVDF może dawać wysokie tło w niektórych obrazownikach western blot; Sprawdź zgodność.
- Wykonaj western blot, aby wykryć interesujące białko za pomocą metody opisanej w innym miejscu.
- Porównaj poziomy białka w próbkach zakażonych pozorowanych i traktowanych inhibitorem.
nuta: Jeśli poziom białka powrócił do normy w zakażonym pasie próbki potraktowanym inhibitorem kaspazy, wówczas białko jest rozszczepiane lub degradowane przez kaspazy. W przeciwnym razie jest degradowany przez lizosom lub proteasom.
- Określ ilościowo odzysk białka, mierząc jego intensywność pasma na każdym torze z co najmniej trzech powtórzeń tego samego eksperymentu i normalizując go za pomocą odpowiedniego pasma kontrolnego obciążenia.
- Użyj dowolnego współczesnego imagera i powiązanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów), aby zobrazować western blot i określić ilościowo odzysk białka.
