1. Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej
UWAGA: Wszystkie prace związane z bakteriami powinny być wykonywane w sterylnych warunkach, aby uniknąć zanieczyszczenia zarówno testu, jak i laboratorium. Wszystkie podłoża powinny być sterylizowane w autoklawie przed użyciem, a plastikowe naczynia i sprzęt, taki jak pipety, muszą być utrzymywane w sterylności. Zaleca się wykonywanie prac w kapturze zabezpieczającym biologicznie (typ 2).
- Szczepy bakterii zawierających glicerol, odpowiednie dla rusztowania antybiotykowego, należy przenieść na agar z bulionu lizogenicznego (LB, przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
nuta: Wybór bakterii do badania aktywności przeciwbakteryjnej musi być dokonany w oparciu o stosowane rusztowanie antybiotykowe. Reprezentatywny zakres 5–10 bakterii powinien zostać wybrany spośród gatunków, o których wiadomo, że są podatne na antybiotyk, z uwzględnieniem możliwości logistycznych laboratorium. Jeśli to możliwe, należy również przebadać oporne bakterie. Poniższy protokół będzie działał na większość bakterii, ale sprawdź, czy wymagane są specjalne warunki (np. CO2 , specjalne pożywki) i w razie potrzeby wprowadź zmiany. Bakterie, które z powodzeniem oznaczono przy użyciu tych warunków, obejmują Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Enterococcus faecium.
- Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i hodować przez noc w 5 ml bulionu Muellera-Hintona z adiunkcją (CAMHB, przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta) w temperaturze 37 °C.
- Rozcieńczyć nocne kultury ~ 40-krotnie w CAMHB i rozebrać do środkowej fazy logarytmicznej, gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) = 0,4–0,8, objętość 5 ml).
- Przygotować roztwory podstawowe każdego antybiotyku fluorescencyjnego w stężeniu 1,28 mg/ml w sterylnej wodzie i odpipetować 10 μl antybiotyku do pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej.
- Dodać 90 μl CAMHB do pierwszej kolumny i 50 μl do wszystkich pozostałych studzienek. Następnie wykonaj seryjne 2-krotne rozcieńczenie na płytce.
- Dokładnie wymieszaj, a następnie rozcieńcz kultury w środkowej fazie logarytmu do ~106 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml i dodaj 50 μl do wszystkich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie ~5 x 105 CFU/ml.
objętość kultury (ml) = (objętość pożywki w ml)/(OD600 x 1,000)
np. dla OD600 = 0,5 kultury w żądanej objętości pożywki 12 ml, dodaj (12/(0,5 x 1,000) = 0,024 ml kultury do 12 ml pożywki
- Przykryć płytki pokrywkami i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18–24 godziny bez wstrząsania.
- Oględziny należy sprawdzić płytki, przy czym wartość MIC jest studzienką o najniższym stężeniu bez widocznego wzrostu.
nuta: W Tabeli 1 przedstawiono kilka przykładów aktywnych i nieaktywnych antybiotyków fluorescencyjnych.
2. Analiza akumulacji sondy za pomocą spektrofotometrii
UWAGA: Te czasy wirowania zostały zoptymalizowane dla E. coli, więc mogą być potrzebne niewielkie zmiany dla innych gatunków. Reprezentatywne dane dotyczące akumulacji sondy są podane dla sondy cyprofloksacyny znakowanej NBD.
- Umieść zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych na agarze LB i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C.
- Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i hodować ją przez noc w LB w temperaturze 37 °C.
- Rozcieńczyć kultury na noc ~50-krotnie w pożywce i wyrosnąć do fazy środkowej (OD600 = 0,4–0,8).
- Odwirować kultury o sile 1,470 x g przez 25 minut i zdekantować pożywkę.
- Zawiesić bakterie w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie odwirować przy 1,470 x g przez 15 minut.
- Zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić umyte granulki w PBS do końcowej średnicy zewnętrznej600 = 2.
- W razie potrzeby dodać 10,1 μl 3-chlorofenylohydrazonu cyjanku karbonylu (CCCP, 10 mM w PBS) do 1 ml bakterii (końcowe stężenie 100 μM) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min.
nuta: CCCP jest inhibitorem pompy wypływowej. Dodanie CCCP pozwoli na zbadanie wpływu odpływu.
- Odwirować kultury w temperaturze 18 000 x g przez 4 minuty w temperaturze 20 °C i zdekantować pożywkę.
- Dodać 1 ml fluorescencyjnego roztworu antybiotyku (10–100 μM w PBS) do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Odwirować kultury przy 18 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C i zdekantować pożywkę.
- Ponownie zawiesić bakterie w 1 ml zimnego PBS i powtórzyć krok 2.9.
- Powtórz krok 2.10 w sumie 4 razy.
- W razie potrzeby poddać bakterie lizie, dodając 180 μl buforu do lizy (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 2 mM EDTA sodu), a następnie 70 μl lizozymu (72 mg/ml w H2O).
- Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min, następnie zamrażać i rozmrażać 3x (−78 °C przez 5 min, następnie 34 °C przez 15 min).
- Sonikować próbki przez 20 minut, a następnie podgrzewać do temperatury 65 °C przez 30 minut.
- Odwirować zlizane próbki (18 000 x g, 8 min), a następnie przefiltrować przez membranę filtracyjną o mocy 10 kDa.
- Umyj filtr 4x 100 μl wody.
- Przenieść lizat na płaskodenną czarną 96-dołkową płytkę i zmierzyć intensywność fluorescencji na czytniku płytek o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednich dla fluoroforu (tj. 7-(dimetyloamino)-2-okso-2H-chromen-4-ylu [DMACA]: λex = 400 nm, λem = 490 nm; nitrobenzoksadiazol [NBD]: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
nuta: Na rysunku 1 przedstawiono przykłady analiz spektrofotometrycznych bakterii z użyciem fluorescencyjnego antybiotyku cyprofloksacyny znakowanego NBD.
