$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Otrzymywanie niezmiennych limfocytów T NK (komórek iNKT) za pomocą adoptywnej terapii komórkowej
- Indukcja kierunkowa ogniw iNKT
- Normalnym myszom wstrzyknąć dootrzewnowo α-Galaktozyloceramid (α-GalCer) (0,1 mg/kg masy ciała).
- Izolacja komórek iNKT
- Trzy dni po modelowaniu wstrzyknij myszom dootrzewnowo 1% pentobarbital sodu (50 mg/kg masy ciała) w celu znieczulenia. Odpowiednio znieczulone myszy nie wykazują reakcji wycofania tylnej łapy na uszczypnięcie palca.
- Odizolować śledzionę myszy DBA/1 po wstrzyknięciu jej dootrzewnowo za pomocą α-GalCer. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, przecinając i mieląc śledzionę na sicie o oczkach 200.
- Przemyć zawiesinę komórkową solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), odwirować przy 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Powtórzyć.
- Ponownie zawiesić komórki w 1 ml krwi pełnej i roztworu do rozcieńczania tkanek. Dodać 3 ml pożywki do separacji limfocytów myszy, a następnie odwirować komórki przez 20 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze pokojowej.
- Zbierz warstwę mlecznobiałych limfocytów (tj. drugą warstwę od góry), umyj ją 2x PBS i policz za pomocą automatycznego licznika komórek.
- Strategia selekcji pozytywnej do oczyszczania komórek iNKT
z magnetycznym aktywowanym sortowaniem komórek (MACS)
nuta: Do wstępnej obróbki tetramerów CD1d, 1 mg/ml α-Galcer rozcieńczono do 200 μg/ml z 0,5% Tween-20 i 0,9% NaCl, a 5 μl otrzymanego roztworu dodano do 100 μl roztworu tetrameru CD1d. Mieszaninę inkubowano przez 12 godzin w temperaturze pokojowej i umieszczono w temperaturze 4 °C do wykorzystania. Receptor limfocytów T (TCR) β rozcieńczono 80-krotnie wodą dejonizowaną. Wszystkie inne przeciwciała stosowano jako roztwór podstawowy.
- Zawiesić 107 komórek w 100 μl PBS o temperaturze 4 °C, dodać 10 μl CD1d tetramer-fiterytryny (CD1d Tetramer-PE) obciążonej α-GalCer i inkubować je w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
- Przemyć komórki 2x PBS i ponownie je zawiesić w 80 μl PBS.
- Dodać 20 μl mikrokulek anty-PE i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
- Umyj je 2x PBS i ponownie zawieś komórki z 500 μL PBS.
- Umieść kolumnę sortującą w polu magnetycznym sortownika MACS i spłucz 500 μl PBS.
- Dodaj zawiesinę komórek z kroku 1.3.4 do kolumny sortującej, zbierz przepływ i przepłucz 3x buforem PBS.
- Usuń pole magnetyczne i zbierz komórki z kolumny sortującej. W tym momencie dodaj 1 ml buforu PBS do kolumny sortującej i szybko popchnij tłok pod stałym ciśnieniem, aby skierować oznakowane komórki do probówki zbiorczej i uzyskać oczyszczone komórki iNKT. Licz za pomocą automatycznego licznika komórek.