Izolowanie niezmiennych limfocytów T NK z modelu mysiego

Streszczenie

Źródło: Meng, M., et al. Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Myszy.J. Vis. Exp.(2020)

Ten film ilustruje metodę izolowania niezmiennych limfocytów T NK, znanych również jako komórki iNKT. Zabieg rozpoczyna się od wstrzyknięcia syntetycznego glikolipidu myszowi w celu stymulacji aktywacji i proliferacji komórek iNKT w śledzionie. Następnie przygotowuje się zawiesiny jednokomórkowe ze śledziony i inkubuje z kompleksami rozpoznającymi komórki iNKT znakowanymi fluoroforami, a następnie rozdziela się za pomocą kulek magnetycznych w celu wyizolowania komórek iNKT.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Otrzymywanie niezmiennych limfocytów T NK (komórek iNKT) za pomocą adoptywnej terapii komórkowej

1. Indukcja kierunkowa ogniw iNKT
   1. Normalnym myszom wstrzyknąć dootrzewnowo α-Galaktozyloceramid (α-GalCer) (0,1 mg/kg masy ciała).
2. Izolacja komórek iNKT
   1. Trzy dni po modelowaniu wstrzyknij myszom dootrzewnowo 1% pentobarbital sodu (50 mg/kg masy ciała) w celu znieczulenia. Odpowiednio znieczulone myszy nie wykazują reakcji wycofania tylnej łapy na uszczypnięcie palca.
   2. Odizolować śledzionę myszy DBA/1 po wstrzyknięciu jej dootrzewnowo za pomocą α-GalCer. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, przecinając i mieląc śledzionę na sicie o oczkach 200.
   3. Przemyć zawiesinę komórkową solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), odwirować przy 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Powtórzyć.
   4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml krwi pełnej i roztworu do rozcieńczania tkanek. Dodać 3 ml pożywki do separacji limfocytów myszy, a następnie odwirować komórki przez 20 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze pokojowej.
   5. Zbierz warstwę mlecznobiałych limfocytów (tj. drugą warstwę od góry), umyj ją 2x PBS i policz za pomocą automatycznego licznika komórek.
3. Strategia selekcji pozytywnej do oczyszczania komórek iNKT
   z magnetycznym aktywowanym sortowaniem komórek (MACS) nuta: Do wstępnej obróbki tetramerów CD1d, 1 mg/ml α-Galcer rozcieńczono do 200 μg/ml z 0,5% Tween-20 i 0,9% NaCl, a 5 μl otrzymanego roztworu dodano do 100 μl roztworu tetrameru CD1d. Mieszaninę inkubowano przez 12 godzin w temperaturze pokojowej i umieszczono w temperaturze 4 °C do wykorzystania. Receptor limfocytów T (TCR) β rozcieńczono 80-krotnie wodą dejonizowaną. Wszystkie inne przeciwciała stosowano jako roztwór podstawowy.
   1. Zawiesić 10⁷ komórek w 100 μl PBS o temperaturze 4 °C, dodać 10 μl CD1d tetramer-fiterytryny (CD1d Tetramer-PE) obciążonej α-GalCer i inkubować je w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
   2. Przemyć komórki 2x PBS i ponownie je zawiesić w 80 μl PBS.
   3. Dodać 20 μl mikrokulek anty-PE i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
   4. Umyj je 2x PBS i ponownie zawieś komórki z 500 μL PBS.
   5. Umieść kolumnę sortującą w polu magnetycznym sortownika MACS i spłucz 500 μl PBS.
   6. Dodaj zawiesinę komórek z kroku 1.3.4 do kolumny sortującej, zbierz przepływ i przepłucz 3x buforem PBS.
   7. Usuń pole magnetyczne i zbierz komórki z kolumny sortującej. W tym momencie dodaj 1 ml buforu PBS do kolumny sortującej i szybko popchnij tłok pod stałym ciśnieniem, aby skierować oznakowane komórki do probówki zbiorczej i uzyskać oczyszczone komórki iNKT. Licz za pomocą automatycznego licznika komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrokulki anty-PE	Miltenyi Miltenyi	Numer katalogowy: 130-048-801	Niemcy
Kolumny	Miltenyi Miltenyi	Ms	Niemcy
Wirówka kriogeniczna	Beckman	Allegra® X-15R	Ameryka
Mysz CD1d Tetramer-PE	Język MBL	TS-MCD-1	Japonia
Percoll myszy	Solarbio (Słoneczna Biologia	Zobacz materiał P8620	Chiny
Mikroskop optyczny	Olympus	Olimp II	Japonia

)