Wzmacnianie transdukcji wirusa w komórkach NK za pomocą polimeru kationowego

Streszczenie

Źródło: Nanbakhsh, A., et al. Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje test na transdukcję wirusa za pośrednictwem kationowego polimeru w komórkach NK (natural killer). Komórki są inkubowane z transgenicznymi wektorami lentiwirusa kodującymi białko fluorescencyjne. Dodanie polimeru kationowego umożliwia wirusowi przyłączenie się do komórek i zintegrowanie swojego RNA z genomem gospodarza, powodując ekspresję białka fluorescencyjnego. Fluorescencję określa się ilościowo w celu oceny indukcji wywołanej przez polimer.

Protokół

1. Transdukcja mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK za pomocą lentiwirusa

1. Zawiesić mysie lub ludzkie pierwotne komórki NK na 24-dołkowej płytce w 0,5 × 10⁵/ml pożywki w obecności supernatantu lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) przy 5, 10 i 20 wielokrotności infekcji (MOI) oraz w obecności Pb (8 μg/ml), PS (8 μg/ml) lub dekstranu (8 μg/ml).
2. Odwirować płytki o masie 1 000 × g przez 60 minut.
3. Bez dekantacji supernatantu należy hodować komórki przez noc (16-18 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5,2% CO_{2 .}
4. Przemyć 10 ml PBS i ponownie zawiesić w 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 w obecności interleukiny 2 (IL-2, 300 U/ml).
5. Zbierz transdukowane komórki NK w 7 dniu, delikatnie stukając w kolby.
   1. Aktywuj pobrane komórki za pomocą miareczkowanych stężeń mAb grupy 2D (NKG2D) (A10) związanych z płytkami, pokrywając 96-dołkowe, wysoce absorbujące białka płytki polistyrenowe stężeniami 2,5 μg/ml mAb anty-NKG2D przez noc.
   2. Przemyć każdą studzienkę 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) trzy razy przed dodaniem pierwotnych komórek NK.
6. Zebrać supernatanty hodowli za pomocą wielokanałowej pipety między 16 a 18 godzinami po aktywacji, aby określić ilościowo cytokiny, takie jak interferon-gamma (IFN-γ). Wygeneruj krzywe standardowe przy użyciu rekombinowanych cytokin dostarczonych z zestawami do testów immunoenzymatycznych (ELISA).
7. Zbadaj żywotność komórek NK za pomocą barwienia aneksyną-V/7-amino-aktynomycyną D (7-AAD) i określ procent komórek martwiczych wśród transformowanych komórek NK za pomocą cytometru przepływowego.
   1. Aby przeprowadzić ten test, należy pobrać mysie i ludzkie komórki NK cztery dni po transdukcji, przemyć dwa razy 10 ml zimnego PBS w ilości 500 × g przez 5 minut każdy i inkubować z zestawem Annexin-V (PE)/7-AAD.
8. Użyj odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej do analizy danych. Wybierz populację żywych komórek i przeanalizuj ekspresję GFP (kanał izotiocyjanianu fluoresceiny [FITC]) jako miarę transdukcji wirusa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dekstran	Sigma-Aldrich	90-64-91-9
Polibren (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
Siarczan protaminy (PS)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał p3369
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Interferon gamma (IFN-γ )	eBionauka	Numer katalogowy: 14-7311-85
Roztwór barwiący Propidium lodide	Bd	51-66211E
Lipofektamina 3000	Rybak termiczny	L3000015
Izofluran	feniks	NDC 57319-559-05
Komórki 293T	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-3216
Kolby T75	Corning	430641U
Zestawy ELISA	Nauka elektroniczna	Numer katalogowy: 00-4201-56