Transfekcja pierwszorzędowych makrofagów zmodyfikowanym mRNA

Streszczenie

Źródło: Herb, M. et al., Wysoce efektywna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje proces transfekcji pierwotnych makrofagów zmodyfikowanym mRNA kodującym zielone białko fluorescencyjne. Te zmodyfikowane mRNA, zaprojektowane w celu zmniejszenia immunogenności i poprawy jej stabilności, zapewniają udaną transfekcję, a następnie ekspresję białek zielonej fluorescencji, co potwierdza mikroskopia fluorescencyjna.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj w rękawiczkach. Wszystkie etapy transfekcji należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek. Przed rozpoczęciem pracy z mRNA wyczyść wszystkie narzędzia, takie jak pipety i każdą powierzchnię, 70% etanolem i/lub środkiem powierzchniowo czynnym rozkładającym RNAse (Tabela materiałów). Upewnij się, że wszystkie probówki reakcyjne są wolne od RNAzy i sterylne. Do rozcieńczania należy używać wyłącznie sterylnej wody wolnej od RNAaz. Używaj wyłącznie końcówek do pipet z filtrami. Wymieniaj końcówki pipet po każdym etapie pipetowania.

1. Generowanie szablonu DNA

UWAGA: Matryca DNA do transkrypcji mRNA in vitro przy użyciu tego protokołu musi zawierać sekwencję promotora T7, aby umożliwić dokowanie polimerazy RNA. Jeśli plazmid zawierający sekwencję DNA białka będącego przedmiotem zainteresowania zawiera już prawidłowo zorientowaną sekwencję promotora T7 bezpośrednio przed sekwencją będącą przedmiotem zainteresowania, należy przeprowadzić linearyzację plazmidu (patrz krok 1.1.). W przeciwnym razie należy dołączyć promotor T7 do sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR, patrz krok 1.2.).

1. Linearyzacja plazmidów zawierających promotory T7
   1. Linearyzuj plazmidy już zawierające prawidłowo zorientowaną sekwencję promotora T7 poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym przecinającym dolny do kodonu stop interesującej sekwencji. W przeciwnym razie transkrypcja nie zakończy się prawidłowo po interesującej sekwencji.
      UWAGA: Najlepiej jest stosować enzymy restrykcyjne pozostawiające końce lub zwisy 5'.
   2. Potwierdź całkowitą linearyzację plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym niestrawionego w porównaniu z strawionym plazmidowym DNA.
   3. Oczyść zlinearyzowany plazmidowy DNA przed użyciem jako matryca DNA do transkrypcji mRNA in vitro za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (tabela materiałów).
2. Mocowanie promotora T7 za pomocą PCR
   1. Użyj startera do przodu zawierającego następujące składniki (we wskazanej kolejności od 5' do 3'): około 5 losowych pz przed promotorem (np. GAAAT); sekwencja promotora T7 (TAATACGACTCACTATAG); dwa dodatkowe G dla zwiększenia wydajności transkrypcji (GG); część specyficzna dla sekwencji docelowej, która jest homologiczna do sekwencji plazmidowej otaczającej kodon start.
      nuta: Powinien składać się z 3-6 pz przed sekwencją KOZAK i kodonem start, sekwencji KOZAK i kodonu start (zwykle GCCACC ATG G), 12-18 pz poniżej kodonu start. Jeśli sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania nie zawiera jeszcze sekwencji KOZAK lub kodonu start, można je dołączyć w tym kroku, po prostu dołączając je do sekwencji startera.
   2. Oblicza się t_m przedniego startera tylko biorąc pod uwagę część homologiczną do sekwencji docelowej.
   3. Aby ocenić tworzenie dimerów/spinek do włosów, należy użyć całej sekwencji podkładu, która z łatwością może przekroczyć 50 pz.
   4. Użyj odwróconego startera znajdującego się gdzieś poniżej kodonu stop.
      UWAGA: Jeśli sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania nie zawiera jeszcze kodonu stop, można go dołączyć w tym kroku, po prostu dołączając go do sekwencji startera.
   5. Użyj starterów do przodu i do tyłu, aby wykonać PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności z korektą (Tabela materiałów).
   6. Potwierdź wytwarzanie pojedynczego produktu i wielkość amplikonu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (np. użyj 1% żelu agarozowego i stałego prądu 100 V).
   7. Oczyść produkt PCR przed użyciem jako matrycę kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) do transkrypcji in vitro informacyjnego kwasu rybonukleinowego (mRNA) za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.

2. Generacja mRNA

1. Rozmrozić wszystkie składniki zestawu do transkrypcji mRNA in vitro (patrz tabela materiałów). Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
2. Przygotować mieszaninę reakcyjną do transkrypcji mRNA in vitro w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml w następującej kolejności (całkowita objętość 40 μL): 20 μL mieszaniny 10x analogów anty-reverse cap/trifosforanu nukleozydu (ARCA/NTP) (zawartych w zestawie do transkrypcji mRNA in vitro); 0,25 μl trifosforanu 5-metylocytydyny (5-mCTP) (stężenie końcowe (f.c.) wynosi 1,25 mM; 50% całkowitego CTP); 0,25 μL pseudo-urydynotrifosforanu (pseudo-UTP) (f.c. wynosi 1,25 Mm; 50 % całkowitych nieuczciwych praktyk handlowych); X μL matrycy DNA; 2 μl mieszaniny polimerazy RNA T7 (wchodzącej w skład zestawu do transkrypcji mRNA in vitro); Y μL H₂O. wolne od RNAz.
   UWAGA: X to objętość zawierająca co najmniej 1 μg DNA. Na przykład 1,6 μl z roztworu podstawowego 625 ng/μl. Y jest objętością zapasową do całkowitej objętości 40 μl.
3. Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 400 obr./min na mieszalniku termicznym do transkrypcji in vitro.
4. Następnie dodać 2 μl DNazy I bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej w celu usunięcia matrycowego DNA. Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut przy 400 obr./min na mieszalniku termicznym. Pobrać porcję 2 μl na żel kontrolny (krok 3.3) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
6. W przypadku ogonowania poli(A) należy dodać następujące składniki bezpośrednio do poprzedniej mieszaniny reakcyjnej (do końcowej objętości 50 μl): 5 μl 10x buforu reakcyjnego polimerazy poli(A) i 5 μl polimerazy poli(A) (oba zawarte w zestawie do transkrypcji mRNA in vitro). Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
7. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 400 obr./min na termomikserze. Pobrać porcję 2 μl na żel kontrolny (krok 3.3) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
8. W celu defosforylacji końców 5' mRNA należy dodać następujące składniki bezpośrednio do poprzedniej mieszaniny reakcyjnej (do końcowej objętości 60 μL): 3 μL H₂O wolne od RNAzy; 6 μL 10x buforu reakcyjnego fosfatazy antarktycznej; 3 μL fosfatazy antarktycznej (15 jednostek na 60 μl objętości reakcyjnej). Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
9. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy 400 obr./min na mieszalniku termicznym.
10. Fosfataza antarktyczna inaktywowana termicznie przez inkubację w temperaturze 80 °C przez 2 min.
    nuta: Najlepiej użyć oddzielnego miksera termicznego, nie czekaj, aż pierwszy mikser osiągnie żądaną temperaturę.

3. Oczyszczanie mRNA

1. Oczyść transkrybowane mRNA in vitro za pomocą dedykowanego zestawu do oczyszczania RNA (tabela materiałów).
   1. Dodać X μl roztworu elucyjnego do mieszaniny reakcyjnej mRNA z kroku 2.10. Wymieszaj, odwracając 5 razy. Dodać 300 μl koncentratu roztworu wiążącego. Wymieszać delikatnie pipetując 5 razy.
      UWAGA: X to objętość zapasowa do całkowitej objętości 100 μL. Na przykład dodaj 40 μl roztworu elucyjnego do 60 μl mieszaniny reakcyjnej mRNA.
   2. Dodać 100 μl etanolu wolnego od RNAaz. Wymieszać delikatnym pipetowaniem 5 razy.
   3. Umieść kolumnę filtrującą w jednej z dostarczonych probówek zbiorczych. Delikatnie przenieś mieszaninę reakcyjną mRNA na środek filtra, nie dotykając filtra. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
   4. Ostrożnie podnieś kolumnę filtrującą i wyrzuć przepływ z rurki zbiorczej. Umieść kolumnę filtra z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
   5. Dodać 500 μl roztworu myjącego (nie zapomnij dodać 20 ml etanolu wolnego od RNAaz przed pierwszym użyciem roztworu myjącego).
   6. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Powtórzyć kroki 3.1.4-3.1.6, aby umyć jeszcze raz.
   7. Wirować z pełną prędkością (17 900 x g) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki płynu z kolumny filtra. Ostrożnie wyjmij kolumnę filtracyjną z rurki zbiorczej. Umieść kolumnę filtracyjną w nowej probówce zbiorczej.
   8. Dodać 50 μl buforu elucyjnego na środek filtra, nie dotykając filtra. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut na mieszalniku termicznym.
   9. Wirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyjmij kolumnę filtracyjną i wyrzuć ją.
2. Zmierzyć stężenie i czystość wymytego mRNA, na przykład za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego do pomiaru absorbancji przy 260 i 280 nm.
   UWAGA: Stosunek A260/A280 wynoszący 1,8-2,1 wskazuje na wysoce oczyszczone mRNA.
3. Sprawdzić obecność pojedynczego produktu, prawidłową długość transkryptu i ogonowanie poli(A), analizując podwielokrotności z kroków 2.5 i 2.7 za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w warunkach denaturacji (na przykład użyć 1,2% żelu agarozowego zawierającego 20 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego [MOPS], 5 mM octanu sodu, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 20% formaldehydu i uruchomić w 20 mM MOPS, 5 mM octanu sodu, 1 mM EDTA i 0,74 % formaldehydu przy stałym prądzie 100 V).
4. Oczyszczone mRNA należy przechowywać w probówce elucyjnej w temperaturze -80 °C do czasu transfekcji. Jeśli używasz tylko niewielkich ilości mRNA do transfekcji, podziel mRNA na porcję, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
   UWAGA: mRNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez około 1 rok.

4. Przygotowanie makrofagów

1. Eutanazja myszy C57/BL6 (użyj myszy tej samej płci i w wieku 6-24 tygodni) przez zwichnięcie szyjki macicy.
   UWAGA: Te same myszy można wykorzystać do izolacji pierwotnych makrofagów (PM) (krok 4.2) i generowania BMDM (kroki 4.3 i 4.4). Do izolacji PM użyj co najmniej dwóch myszy. Jeśli ma być wygenerowany tylko BMDM, zwykle wystarczy jedna myszka.
2. Immunomagnetyczne wzbogacanie makrofagów otrzewnowych.
   1. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml kaniulą 0,9 x 40 mm 8 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 2 ml powietrza. Przepłukać jamę otrzewnej PBS. Powietrze utworzy pęcherzyk, który zminimalizuje wyciek PBS.
   2. Tą samą strzykawką szybko zbierz płukanie otrzewnej i przenieś je do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby połącz komórki otrzewnej wielu myszy. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie.
   3. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml 0,2 % NaCl przez 30 s w celu lizy czerwonych krwinek.
   4. Dodaj 5 ml 1,6% NaCl do całkowitej objętości 10 ml, aby odtworzyć warunki izotoniczne. Wirować przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 97,5 μl buforu do magnetycznego sortowania komórek (MCS) (2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA], 0,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] w PBS) na 1 płukanie otrzewnowej (np. jeśli trzy myszy zostały wypłukane, ponownie zawiesić w 292,5 μl).
   6. Dodać 2,5 μl kulek paramagnetycznych sprzężonych z przeciwciałem specyficznym dla CD11b na 97,5 μl zawiesiny komórkowej (np. dodać 7,5 μl do 292,5 μl).
   7. Inkubować na lodzie przez 15 minut przy 150 obr./min na wytrząsarce orbitalnej.
   8. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu MCS.
   9. Dodać 4 ml buforu MCS do całkowitej objętości 5 ml i przemyć komórki, delikatnie pipetując trzykrotnie w górę i w dół.
   10. Powtórzyć kroki 4.2.8 i 4.2.9 jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy etapy mycia.
   11. Podczas etapów mycia umieść kolumnę LS w separatorze magnetycznym (patrz Tabela materiałów). Przepłukać kolumnę 3 ml buforu MCS.
       nuta: Unikaj pęcherzyków, ponieważ mogą one zatkać kolumnę.
   12. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu MCS. Dodać 3 ml buforu MCS do całkowitej objętości 4 ml i wymieszać, pipetując trzy razy w górę i w dół.
   13. Przenieść 4 ml zawiesiny komórek na przepłukaną kolumnę LS.
       UWAGA: Ponownie, unikaj wszelkich pęcherzyków, ponieważ mogą one zatkać kolumnę.
   14. Poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie całkowicie pusty. Nie dodawaj dodatkowego płynu, dopóki kolumna nie przestanie kapać.
   15. Dodać 3 ml buforu MCS do kolumny. Następnie poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie całkowicie pusty. Powtórz krok 4.2.15 jeszcze dwa razy.
   16. Umieść kolumnę LS w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Nałożyć 5 ml buforu MCS na kolumnę. Poczekaj, aż 2 ml płynu przejdzie przez kolumnę, a następnie użyj tłoka, aby delikatnie wepchnąć pozostałą frakcję do probówki.
   17. Odwirować zawiesinę komórek o sile 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   18. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS) (DMEM+FCS).
   19. Określić liczbę żywotnych komórek, licząc w roztworze błękitu trypanowego w komorze liczącej Neubauera i komórki nasienne w DMEM+FCS na płytki hodowlane.
       UWAGA: Wysiew PM o gęstości 100 000 komórek/studzienkę na płaskiej płytce do mikromiareczkowania. Nie należy używać płytek poddanych hodowlom tkankowym, ponieważ nie można od nich oderwać cząstek stałych. Zamiast tego użyj nieobrobionych płytek.
3. Generacja BMDM
   1. Usuń skórę i mięśnie z tylnych nóg za pomocą nożyczek. Umyj każdą nogę przez krótkie zanurzenie w 70% etanolu.
   2. Odłącz nogi i otwórz oba końce kości udowej i piszczelowej, przecinając nożyczkami.
   3. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml wypełnioną kaniulą 0,6 mm x 30 mm 5 ml roztworu RPMI 1640 o bardzo niskiej zawartości endotoksyn (VLE) i wypłucz szpik kostny z otwartych kości do naczynia hodowlanego.
   4. W razie potrzeby połącz szpik kostny wielu myszy, powtarzając kroki 4.3.1-4.3.3. Przenieść szpik kostny do stożkowej probówki wirowej o pojemności 50 ml.
   5. Odwirować zawiesinę szpiku kostnego o sile 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad.
   6. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (8,3% chlorku amonu, NH₄Cl, 0,1 M Tris) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek.
   7. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 650 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
   8. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% HEPES, 1% pirogronianu sodu i 10 ng/ml rekombinowanego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) (RPMI+++++).
   9. Dodaj 4 ml RPMI+++++ do całkowitej objętości 5 ml.
   10. Przygotować 5 szalek Petriego o wymiarach 92 mm x 16 mm bez obróbki z krzywkami (patrz tabela materiałów) na mysz, pipetując 7 ml pożywki RPMI+++++ do każdej płytki
   .
   11. Przenieść 1 ml roztworu komórkowego na 5 przygotowanych szalek hodowlanych i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   12. Po 4 dniach nakarm komórki, dodając 4 ml RPMI+++++. Po 6-7 dniach komórki szpiku kostnego są w pełni zróżnicowane do BMDM.
4. Zbiór BMDM
   1. Całkowicie usuń pożywkę z naczyń hodowlanych. Dodaj 5 ml ciepłego 0,2 mM EDTA w PBS do każdego naczynia.
   2. Delikatnie zeskrob całą płytkę za pomocą skrobaka do komórek, aby odłączyć BMDM. Połączyć zawiesiny komórek w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
   3. Ponownie przepłucz wszystkie 5 naczyń. Użyj tej samej objętości 5 ml ciepłego 0,2 mM EDTA w PBS dla wszystkich 5 potraw. Połącz tę zawiesinę komórek z tą z poprzedniego kroku.
   4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki VLE RPMI 1640 uzupełnionej 10% FCS, 1% HEPES, 1% pirogronianem sodu i 10 ng/ml rekombinowanego M-CSF, ale bez antybiotyków (RPMI^++++).
   6. Określić liczbę żywotnych komórek, licząc w roztworze błękitu trypanowego w komorze liczącej Neubauera i komórki nasienne w RPMI⁺⁺⁺⁺ na płytki hodowlane.
      nuta: Wysiewać BMDM o gęstości maksymalnie 50 000 komórek/studzienkę na płaskiej płytce do mikromiareczkowania. Nie należy używać płytek poddanych hodowli tkankowej, ponieważ BMDM trudno od nich odłączyć. Zamiast tego użyj nieobrobionych płytek.

5. Transfekcja makrofagów za pomocą mRNA

1. Obliczyć wymaganą objętość buforu do transfekcji mRNA.
   nuta: Wymagana objętość buforu transfekcji mRNA zależy od wielkości studzienki: użyj 200 μl do transfekcji na płytce 6-dołkowej, 100 μl na płytce 12-dołkowej i tak dalej. Zawsze należy dodać trochę wolnej objętości ze względu na straty przy pipetowaniu (ale nie za dużo, aby zapobiec nadmiernemu rozcieńczeniu mRNA). Na przykład użyj 450 μL zamiast 4 x 100 μL = 400 μL do transfekcji w 4 dołkach 12-dołkowej płytki.
2. Oblicz wymaganą objętość odczynnika do transfekcji mRNA. Odczynnik do transfekcji mRNA dodaje się w stosunku 1:50. Na przykład 9 μl odczynnika do transfekcji mRNA jest wymagane do uzyskania końcowej objętości 450 μl.
3. Oblicz całkowitą wymaganą ilość mRNA. Do efektywnej transfekcji wymagane jest co najmniej 100 ng na 100 000 makrofagów, 200 ng działa jeszcze lepiej (np. 800 ng mRNA do transfekcji 400 000 makrofagów).
   1. Pomnóż obliczoną ilość wymaganego mRNA przez całkowitą liczbę dołków, które muszą zostać transfekowane (np. 4 dołki z 400 000 makrofagów każdy: 4 x 800 ng = 3 200 ng mRNA jest wymagane łącznie dla wszystkich studzienek). Na przykład, jeśli zapas mRNA wynosi 426,8 ng / μl, 7,49 μl jest potrzebne do optymalnej transfekcji 4 dołków z 400 000 makrofagów każdy.
4. Dodać obliczoną objętość buforu do transfekcji mRNA (krok 5.1.) pomniejszoną o objętości odczynnika do transfekcji mRNA (krok 5.2) i mRNA (krok 5.3) do probówki reakcyjnej. Na przykład 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
5. Rozmrozić zapas mRNA i wymieszać go, delikatnie obracając probówkę elucyjną. Dodać obliczoną objętość mRNA (krok 5.3) do probówki reakcyjnej z buforem reakcyjnym mRNA (w przykładzie przedstawionym powyżej: 7,49 μl w 433,51 μL).
6. Wiruj przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
7. Wirować odczynnik do transfekcji mRNA przez 5 s i wirować przez 2 s przy 2,000 x g.
8. Dodać obliczoną objętość odczynnika do transfekcji mRNA (krok 5.2) do probówki reakcyjnej zawierającej bufor do transfekcji mRNA i mRNA (w przykładzie przedstawionym powyżej: 9 μl odczynnika do transfekcji mRNA).
9. Wiruj mieszankę transfekcyjną przez 5 s i wiruj w dół przez 2 s przy 2,000 x g.
10. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
11. W międzyczasie zastąp pożywkę hodowlaną makrofagów świeżą, ciepłą pożywką hodowlaną (patrz kroki 4.2.18. i 4.4.5).
12. Po etapie inkubacji 5.10 dodać mieszaninę transfekcji do studzienek zawierających makrofagi w objętości odpowiedniej do wielkości studzienki (patrz krok 5.1). Dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami w kółko od zewnątrz do środka studzienki.
13. Delikatnie kołysz płytką, najpierw w pionie, a następnie w poziomie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej w studzience. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ . Synteza białka kodowanego przez transfekowane mRNA rozpocznie się wkrótce po transfekcji. Aby uzyskać najlepsze wyniki, inkubować przez co najmniej 6 godzin.
14. Po inkubacji przeanalizuj wydajność transfekcji za pomocą mikroskopii (immuno)fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej lub immunoblot lub użyj transfekowanych makrofagów do wybranego eksperymentu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-metylo-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	przechowywane w temperaturze -20 °C
Fosfataza antarktyczna	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0289	przechowywane w temperaturze -20 °C
Bufor reakcyjny fosfatazy antarktycznej (10X)	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał B0289	przechowywane w temperaturze -20 °C
anty-NEMO/IKKγ	Invitrogen	MA1-41046	przechowywane w temperaturze -20 °C
przeciwciało anty-β-aktyny	Sigma-Aldrich	Nr kat. A2228	przechowywane w temperaturze -20 °C
szalki Petriego 92,16 mm z krzywkami	Sarstedt	8 21 473	przechowywane w RT
CD11b Mikrogranulki mysz i człowiek	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-049-601	przechowywany w temperaturze 4 °C
Rekombinaza Cre + T7-Promotor podkład do przodu	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', przechowywany w temperaturze -20 °C
Rekombinaza Cre + T7-Promotor odwrócony podkład	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, przechowywany w temperaturze -20 °C
Zestaw do oczyszczania DNA: Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 28104	przechowywane w RT
eGFP + T7-Promotor podkład do przodu	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3', przechowywany w temperaturze -20 °C
Podkład odwrotny eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', przechowywany w temperaturze -20 °C
Bufor szybkiego trawienia (10X)	Thermo Scientific	Zobacz materiał B64	przechowywane w temperaturze -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	przechowywane w temperaturze -20 °C
Polimeraza o wysokiej wierności z korektą: Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności	Nowa Anglia Biolabs Inc	Zobacz materiał M0491S	przechowywane w temperaturze -20 °C
IKKβ + T7-Promotor podkład do przodu	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, przechowywany w temperaturze -20 °C
IKKβ + T7-Promotor podkład odwrócony	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, przechowywany w temperaturze -20 °C
zestaw do transkrypcji mRNA in vitro: zestaw mRNA HiScribe T7 ARCA (z ogonem poliA)	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	E2060	przechowywane w temperaturze -20 °C
Kolumny LS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-401	przechowywane w RT
Stojak wielofunkcyjny MACS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-303	przechowywane w RT
Bufor do transfekcji mRNA i odczynnik: jetMESSENGER	Transfekcja Polyplus	409-0001DE	przechowywany w temperaturze 4 °C
Zmutowany plazmid IKKβ IKK-2S177/181E	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 11105	przechowywane w temperaturze -20 °C
Zmutowany plazmid NEMOC54/347A	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 27268	przechowywane w temperaturze -20 °C
Plazmid pEGFP-N3	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 62043	przechowywane w temperaturze -20 °C
Poli(I:C)	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	528906	przechowywane w temperaturze -20 °C
Plazmid pPGK-Cre			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nowe warianty indukowalnej rekombinazy Cre: Nowy mutant białka fuzyjnego Cre-PR wykazuje zwiększoną czułość i rozszerzony zakres indukowalności. Kwasy nukleinowe Res. 29, 47e (2001). przechowywane w temperaturze -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	przechowywane w temperaturze -20 °C
Separator QuadroMACS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-090-976	przechowywane w RT
Szczuro-anty-mysie przeciwciało CD11b, sprzężone z APC	Legenda biologiczna	101212	przechowywany w temperaturze 4 °C
Przeciwciało F4/80 przeciwko myszy, sprzężone z PE	eBionauka	Numer katalogowy: 12-4801-82	przechowywany w temperaturze 4 °C
rekombinowany M-CSF	Peprotech	315-02	przechowywane w temperaturze -20 °C
Zestaw do oczyszczania RNA: Zestaw do czyszczenia transkrypcji MEGAclear	ThermoFisher Naukowy	AM1908	przechowywany w temperaturze 4 °C
Środek powierzchniowo czynny rozkładający RNAzy: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	Czynnik chłodniczy 2020	przechowywane w RT
Ultraczysty LPS z E.coli O111:B4	Szczepionka Invivogen		przechowywane w temperaturze -20 °C
Plazmid IKKβ typu dzikiego	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 11103	przechowywane w temperaturze -20 °C
Plazmid NEMO typu dzikiego	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 27268	przechowywane w temperaturze -20 °C