Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB. Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
>1. Generacja myszy HIS
- Hodowla myszy BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) myszy
nuta: Szczep ten ma skrajnie niedobór odporności, nie ma komórek T, B ani komórek NK (natural killer). Dlatego należy stosować rygorystyczne środki, aby zapobiec infekcjom oportunistycznym. Utrzymuj kolonię na diecie zawierającej trimetoprim i sulfadiazynę na przemian 2-tygodniowy harmonogram z normalną dietą. Utrzymuj najwyższy możliwy poziom ostrożności w pomieszczeniu mieszkalnym (np. prysznic z barierką dla osób niepełnosprawnych z ograniczonym dostępem).
- Utrzymuj kolonie myszy homozygotycznych BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) i BALB/c Rag2null Il2RγCnull SirpaBalb/c (BRG) jako rozrodcze.
- Hodowla BRGSN/N×BRGB/B w celu uzyskania szczeniąt BRGSB/N, które mają być wykorzystane jako biorcy ludzkich komórek macierzystych. W tej kolonii BRGSB/N są zdrowsze niż BRGSN/N i wszczepiają się na równoważnym poziomie (więcej niż BRG).
- Izolacja ludzkich komórek macierzystych CD34+ z krwi pępowinowej (CB)
nuta: Do tej procedury nie stosuje się antybiotyków. Dlatego niezbędna jest dobra sterylna technika.
- Umieść stożkowy stojak na probówki o pojemności 50 ml, a także 3 stożkowe probówki o pojemności 15 ml i ~10 x 50 ml w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Spryskaj worek do pobierania krwi 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia w BSC.
- Obliczyć liczbę stożkowych probówek o pojemności 50 ml wymaganych do izolacji gradientu gęstości CB = objętość CB/15, zaokrąglonych w górę i do parzystej liczby probówek. Obliczyć objętość krwi na probówkę = objętość CB/liczba probówek. Ostrożnie wlej krew z worka CB do każdej stożkowej probówki; jest to maksymalnie 15 ml na probówkę. Za pomocą pipety automatycznej i pipety serologicznej o pojemności 25 ml wymieszać krew w stosunku 1:1 ze sterylnym PBS, pipetując w górę i w dół.
- Użyć pipetora automatycznego o niskiej prędkości i pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby powoli podsycić krew roztworem gradientu gęstości o temperaturze pokojowej (RT) 1,077 g/ml (patrz tabela materiałów) bez naruszania interfejsu. Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała dna probówki. Powtórz dla wszystkich probówek. Następnie wirować przez 30 minut przy 850 x g, bez hamowania, w temperaturze pokojowej, aby zapewnić utrzymanie gradientu gęstości.
- Wizualizuj komórkową sierść kożuchową na gradiencie gęstości 1,077 g / ml jako mętną białą warstwę. Usunąć i wyrzucić warstwę osocza do około 10 ml powyżej kożucha za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i pipetora automatycznego.
- Zebrać kożuszek za pomocą sterylnego transferu lub pipety serologicznej. Użyj pipety jak szpatułki, aby zeskrobać komórki z boku stożkowej rurki, jednocześnie zwalniając bańkę (lub powoli pipetując), aby wyciągnąć komórki do góry. Połącz kożuchy z dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml w jedną nową stożkową rurkę o pojemności 50 ml.
- Umyj komórki, wlewając 45 ml sterylnego zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do każdej stożkowej probówki. Wirować przez 11 minut przy 360 x g przy wilgotności względnej.
- Zassać media płuczące do granulatu we wszystkich probówkach. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pipety automatycznej ponownie zawiesić pierwsze osadki w 10 ml HBSS zawierającej 2% FBS. Ponownie zawiesić każdą osadkę w tych samych 10 ml HBSS i przepłukać każdą probówkę dodatkowymi 10 ml HBSS, aby zebrać wszystkie komórki do jednej probówki.
- Wlać 45 ml sterylnego HBSS zawierającego 2% FBS do stożkowej probówki. Wirować przez 10 minut przy 360 x g, w temperaturze 4 °C.
- Zassać bufor płuczący do osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad w 20 ml bufora magnetycznego separatora komórek (patrz Tabela materiałów). Usunąć małą porcję, aby policzyć komórki za pomocą hemacytometru w rozcieńczeniu 1:20 w błękitu metylenowego. Dodaj liczbę niebieskich i białych komórek. Wirować przy 360 x g, przez 10 min w temperaturze 4 °C.
nuta: Protokół ten wykorzystuje technologię kulek magnetycznych (patrz tabela materiałów). Protokół może być modyfikowany do użytku z dowolną technologią separacji komórek, przy wystarczającej czystości i wydajności komórek macierzystych CD34+.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek CD34+ wyizolowany z krwi pępowinowej w 300 μl buforu magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek. Najpierw dodaj 100 μl odczynnika blokującego receptor Fc (FcR), a następnie 100 μl kulek magnetycznych CD34+ na 1 x10 8 komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut (bez lodu).
- Dodać 5 ml buforu magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek i wirować w temperaturze 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap płukania i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml oznaczonej jako "niefrakcjonowana".
- Oznacz jeszcze dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml "CD34-" i "CD34+". Umieść trzy stożkowe probówki o pojemności 15 ml (niefrakcjonowane, CD34- i CD34+) w szczelinach A1, B1 i C1 odpowiednio na stojaku chłodzącym (patrz tabela materiałów). Rozdzielić ogniwa za pomocą dwukolumnowego programu selekcji pozytywnej na automatycznym magnetycznym separatorze ogniw (patrz Tabela materiałów) w BSC, zgodnie z instrukcjami producenta przyrządu.
- Namnażanie i zamrażanie ludzkich komórek macierzystych CD34+
- Podniec 10 μl odzyskanej zawiesiny komórek CD34+ (2 ml) na szkiełku hemocytometrycznym i policzyć komórki pod 10-krotnym powiększeniem. Oblicz całkowitą liczbę komórek CD34+, mnożąc liczbę komórek przez 2 x 104. Podziel całkowitą liczbę komórek CD34+ przez 250 000, aby obliczyć liczbę fiolek do zamrożenia (50 000 komórek na młode myszy przed ekspansją in vitro).
- Przygotować CB pożywkę Iscove's 10% płodowa surowica cielęca (FCS) (plus 1 ml dodatkowo na utratę filtracji), uzupełnioną czynnikiem komórek macierzystych 40 ng / mL, ligandem 3 kinazy tyrozynowej podobnej do FMS 20 ng / ml (Flt3L) i 10 ng / ml interleukiny-6 (IL-6) i przepuścić przez filtr 0,22 μm. Ponownie zawiesić komórki CD34+ w stężeniu 100 000 na ml pożywki CB i inkubować w temperaturze 37 °C. W dniu 3 dodać równoważną objętość pożywki CB bez cytokin do kolby zawierającej komórki i pożywki CB z cytokinami.
nuta: Dodanie tych cytokin do pożywki CB sprzyja przetrwaniu i ekspansji komórek CD34 +, jednocześnie zapobiegając ich różnicowaniu.
- Zbierz rozszerzone komórki CD34+ w 5 dniu. Odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół i zebrać w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać tyle podłoża CB, aby pokryć dno kolby. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać całe dno kolby. Zebrać wszystkie podłoża do tej samej probówki o pojemności 50 ml i wirować przy 360 x g przez 11 minut.
- Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki CB. Ostatnią kroplę z pipety należy zapisać na 96-dołkowej płytce w celu zliczenia. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:1 w błękitu trypanowym i dodać 10 μl do hemacytometru, a następnie policzyć i uśrednić komórki z czterech ćwiartek. Oblicz całkowitą liczbę komórek CD34 +, mnożąc liczbę komórek przez 4 x 104 i zapisz żywotność.
- Przygotować n+1 ml pożywki do zamrażania, gdzie n jest liczbą fiolek do zamrażania obliczoną w kroku 1.3.1. Przygotować pożywkę do zamrażania, dodając 10% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO) do FBS i przechowywać na lodzie. Oznacz kriowiale CB#, CD34+ d5 i datą.
- Odwiruj komórki CD34+ w temperaturze 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zassać pożywkę do osadu i ponownie zawiesić osad komórkowy w podłożu zamrażającym. Podać podaniec 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej fiolki i równomiernie podzielić pozostałą ilość między fiolki. Dodać fiolki do zamrażarki izopropanolowej schłodzonej do temperatury 4 °C, umieścić w temperaturze -80 °C i przenieść do ciekłego azotu w celu przechowywania przez >90 dni.
- Napromienianie szczeniąt myszy
- Zbierz młode BRGSB/N 1-3 dni po urodzeniu do autoklawowanego plastikowego pudełka z wyściółką. Dodaj niewielką ilość ściółki ze szczeniętami. Oznacz pudełko numerem klatki i liczbą szczeniąt.
- Ustaw naświetlacz (patrz Tabela materiałów) na dawkę 300 rad. Umieść pudełko szczeniąt w naświetlaczu i wystaw je na działanie 300 rad. Zabierz szczenięta z powrotem do klatki, umieść je w stosie i przykryj ściółką.
- Iniekcje dla szczeniąt i preparatyka komórek CD34+
- Przygotowanie komórek CD34+ rozpocząć ~3 godziny po napromieniowaniu. Podgrzej 10 ml pożywki CB w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym BSC.
- Pobrać jedną fiolkę z rozszerzonymi i zamrożonymi komórkami CD34 + in vitro na każde cztery do sześciu szczeniąt do wstrzyknięcia. Szybko rozmrozić w temperaturze 55 °C, aż będzie widoczna niewielka ilość lodu, a następnie dodać komórki do podgrzanej pożywki CB (fiolka powinna być nadal chłodna w dotyku). Użyć 1 ml pożywki do przepłukania każdej fiolki i wirowania komórek w temperaturze 360 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Stwierdzono, że szybkie rozmrażanie w temperaturze 55 °C zapewnia lepszą żywotność komórek (90%-95%) niż rozmrażanie w temperaturze 37 °C.
- Ostrożnie zassać pożywkę. Zawiesić (mały) osad w 2 ml pożywki CB, delikatnie wymieszać i dodać ~30 μl zawiesiny komórek do jednego dołka na płytce liczącej. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 w błękitu trypanowym, następnie dodać 10 μl do hemocytometru i policzyć i uśrednić komórki z czterech ćwiartek.
- Oblicz całkowitą liczbę komórek CD34+, mnożąc liczbę komórek przez 4 x 104, a następnie zapisz żywotność. Wirować w temperaturze 360 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl sterylnego PBS na n + 1 młode do wstrzyknięcia, co daje 250 000-450 000 komórek CD34 + na mysz. Umieść stożkową rurkę na lodzie w pojemniku transportowym i udaj się do wiwarium w celu wstrzyknięcia szczeniąt.
- Do wiwarium BSC należy przynieść lampę grzewczą, pieluchy, strzykawkę 1 ml, igłę 18 g, igłę 30 g oraz preparat komórkowy CD34+ w sterylnych pojemnikach. Umieść sterylną pieluchę ~ 2 stopy pod lampą grzewczą. Wyjmij klatkę ze ściółką, która ma zostać wstrzyknięta i umieść ją w BSC.
- Złożyć strzykawkę z igłą ze skosem 18 G. Dopasowując kąt rurki stożkowej do skosu igły, delikatnie wymieszaj i wciągnij zawiesinę komórkową. Umieść szczenięta na pieluszce, aby się rozgrzały (uważaj, czy się nie przegrzeje). Usunąć powietrze ze strzykawki i zastąpić igłę 18 G igłą 30 G, a następnie ostrożnie wcisnąć strzykawkę, aż zawiesina komórek znajdzie się tuż przy końcówce igły.
nuta: Alternatywnie można użyć strzykawki insulinowej.
- Zabieraj jednego szczeniaka na raz na krawędź pieluszki z dala od lampy grzewczej. Unieruchamiaj szczeniaka na boku pod kciukiem i palcem wskazującym, aby uzyskać wyraźny widok twarzy. Zwróć uwagę na żyłę w poprzek policzka pod miejscem, w którym będzie ucho. Wbić igłę płytko do żyły (IV) znajdującej się najbliżej oka i powoli wstrzyknąć 50 μl komórek.
- Sprawdź, czy po wstrzyknięciu podskórnym nie tworzy się pęcherzyk. Jeśli tak, wbij igłę głębiej i przystąp do wstrzykiwania komórek. Niewielka kropla krwi/krwiak będzie widoczna, gdy się powiedzie.
- Gdy szczenię jest nadal unieruchomione, wykonaj wstrzyknięcie dowątrobowe (IH) z kolejnymi 50 μl komórek (łącznie 100 μl na młode IV+IH). Wątrobę można uwidocznić jako ciemną plamę między białym pasmem mleka a klatką piersiową. Umieść szczenię, któremu wstrzyknięto zastrzyk, na pieluszce z dala od szczeniąt, którym nie wstrzyknięto iniekcji i podgrzej.
nuta: Iniekcja dożylna powoduje lepszą długoterminową chimerię niż sama iniekcja IH, ale iniekcje dożylne nie zawsze są skuteczne. Dlatego podzielenie wstrzyknięcia między IV i IH zapewnia wszczepienie do większego odsetka myszy.
- Powtórz zarówno wstrzyknięcia do żyły twarzowej, jak i IH dla wszystkich szczeniąt. Oczyść krew, przywróć młode do gniazda w klatce i przykryj ściółką.
