Terapia uzupełniająca w modelu mysim z niecałkowicie wyciętym guzem podskórnym

Streszczenie

Źródło: Rwandamuriye, F. X. et al., Mysi model niekompletnie wyciętego mięsaka tkanek miękkich do testowania terapii (neo)adjuwantowych.J. Vis. Exp.(2020)

Ten film ilustruje testowanie terapii uzupełniającej lub dodatkowej na modelu mysim z niekompletnie wyciętymi guzami podskórnymi. Mysz z częściowo wyciętym guzem jest leczona przeciwciałem skierowanym przeciwko antycytotoksycznemu białku komórek regulatorowych T, potencjalnie zmniejszając odrost guza i sugerując skuteczną terapię uzupełniającą.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Inokulacja komórek

1. Przygotowanie komórek i zwierząt
   1. Upewnij się, że linia komórkowa jest utrzymywana w zalecanym pożywce. Na przykład utrzymuj linię komórkową WEHI 164 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnioną 2 mM L-glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 0,05 mM 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
      nuta: Komórki pasażowe co najmniej 3 i do 5 razy po wyjęciu z magazynu kriogenicznego. Aby zapewnić optymalną żywotność komórek, komórki powinny być dzielone, gdy zlewają się w 70-80%. Linie komórek nowotworowych powinny być badane na obecność mykoplazmy, ponieważ infekcja może zmieniać wzrost komórek i wpływać na odpowiedź immunologiczną in vivo.
   2. Dzień przed inokulacją należy ogolić myszy na prawym dolnym boku za pomocą maszynki do strzyżenia.
      nuta: W tym eksperymencie wykorzystano samice myszy BALB/c w wieku od 8 do 12 tygodni, o normalnej wadze (16 -22 gramy).
   3. W dniu inokulacji należy pobrać komórki WEHI 164, gdy 70-80% zlewają się przez trypsynizację.
      1. Odessać pożywkę hodowlaną z kolb do hodowli tkankowych, a następnie dodać sterylny roztwór buforowany fosforanem (1x PBS), aby usunąć pozostałe ślady płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
      2. Odessać PBS z kolb do hodowli tkankowych. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny (dla kolby T75), a następnie zamieszać kolbę tak, aby cała powierzchnia kolby z komórkami była pokryta trypsyną.
      3. Inkubować kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 minuty. Okresowo sprawdzać komórki, stukając w boki kolby, aby zobaczyć, czy komórki się przemieściły.
      4. Wyjąć kolby z inkubatora do hodowli komórkowych i dodać 5 ml pożywki uzupełnionej FBS w celu zneutralizowania trypsyny.
         nuta: Nie pozostawiaj komórek w trypsynie dłużej niż to konieczne, ponieważ może to uszkodzić komórki i prowadzić do niskiej żywotności komórek.
      5. Odpipetować zawiesinę wiele razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej.
      6. Granulki wirować z prędkością 350 x g przez 3 min.
   4. Umyj komórki trzy razy w 1x PBS.
      1. Ponownie zawiesić komórki w 50 ml sterylnego 1x PBS i umyć komórki, pipetując zawiesinę komórek w górę iw dół. Granulki wirować z prędkością 350 x g przez 3 min.
      2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 ml sterylnego 1x PBS. Umyj komórki, pipetując zawiesinę komory w górę iw dół. Granulki wirować z prędkością 350 x g przez 3 min.
      3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki dokładnie w 10 ml sterylnego 1x PBS. Umyć komórki jak w kroku 1.1.4.2 i przenieść niewielką ilość (około 100 μl) zawiesiny komórek do probówki wirówkowej w celu zliczenia. Granulki wirować z prędkością 350 x g przez 3 min.
   5. Określ liczbę komórek za pomocą metody wykluczenia błękitu Trypana za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić komórki w sterylnym 1x PBS w stężeniu 5 x 10⁶ komórek/ml. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie.
      nuta: Żywotność komórek nowotworowych powinna być równa lub wyższa niż 80%, aby zapewnić powtarzalny wzrost guza.
2. Inokulacja podskórna
   1. Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i napełnić strzykawkę igłą 26 G 100 μl zawiesiny komórek (5 x 10⁵ komórek) w sterylnym 1x PBS. Powtórzyć mieszanie komórek przed załadowaniem następnej strzykawki.
      nuta: Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas trwania zabiegu, aby utrzymać ich żywotność.
   2. Odpowiednio unieruchom, zapewniając dostęp do prawego dolnego boku. Zaszczepij mysz podskórnie na ogolonym prawym dolnym boku.
      nuta: Upewnij się, że inokulacja nie znajduje się w otrzewnej, lekko unosząc igłę, która powinna być widoczna pod skórą. Po zaszczepieniu pod skórą powinna uformować się grudka przypominająca bąbelki.
   3. Monitoruj myszy zgodnie z obowiązującymi zatwierdzeniami etycznymi i wykonaj resekcję chirurgiczną, gdy guzy urosną do rozmiaru około 50 mm².

2. Częściowa chirurgiczna resekcja guza

UWAGA: Ten protokół wymaga DWÓCH badaczy; jednego do zabiegów chirurgicznych (CHIRURG), a drugiego do monitorowania myszy (ASSISTANT).

1. Przygotowanie do zabiegu
   1. W 12 dniu po inokulacji, gdy guzy osiągną rozmiar około 50 mm², podaj myszom 100 μl (0,1 mg / kg) buprenorfiny s.c. w kark szyi, 30 minut przed zabiegiem.
   2. Ustaw obszar operacyjny za pomocą poduszki grzewczej pokrytej płaszczem stołowym i ustaw stożek nosowy do znieczulenia. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne przed użyciem i między każdym zwierzęciem za pomocą sterylizatora kulek termicznych, pozwalając narzędziom ostygnąć przed użyciem. Miej następujący sprzęt chirurgiczny czysty i w zasięgu ręki: chlorheksydyna, wacik, gaza, żel do oczu, dwa zakrzywione kleszcze, nożyczki, aplikator do klipsów, przyrząd do usuwania klipsów i wkłady do klipsów (Rysunek 1A, 1B).
   3. Ogrzej komorę grzewczą do 37 °C i ustaw kolejną poduszkę grzewczą w celu odzyskania (Rysunek 1C). Umieść wysterylizowane narzędzia na sterylnej powierzchni, takiej jak autoklawowane podkładki.
2. znieczulenie
   1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczul mysz 4% izofluranem (4% w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min), aż częstość oddechów zwolni do około 60 oddechów na minutę (1 na sekundę) (zwykle trwa to <1 min).
      nuta: Nie zostawiaj myszy w komorze zbyt długo, ponieważ może to doprowadzić do uduszenia i śmierci. Miej tylko jedną mysz pod narkozą na raz.
   2. Przenieś mysz na poduszkę grzewczą na stole operacyjnym, umieść mysz z nosem w stożku nosowym i utrzymuj stan znieczulenia za pomocą 3-4% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 0,5 l/min. Monitoruj częstość oddechów, aby upewnić się, że głębokość znieczulenia jest utrzymana.
      nuta: ASYSTENT musi monitorować oddech myszy przez cały czas trwania zabiegu, aby zapewnić utrzymanie prawidłowego poziomu znieczulenia. Zmniejsz stężenie środka znieczulającego, jeśli oddech staje się zbyt wolny lub zwiększ stężenie, jeśli głębokość znieczulenia jest zbyt płytka. Jeśli mysz zacznie sapać, wyjmij mysz ze stożka nosowego, zmniejsz stężenie środka znieczulającego i poczekaj, aż oddychanie się unormuje, zanim ponownie umieścisz ją na stożku nosowym.
   3. Wykonaj "test szczypania" i "test odruchu rogówkowego", aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona przed rozpoczęciem operacji.
      nuta: Ruch jakiejkolwiek części myszy wskazuje, że mysz nie jest w pełni znieczulona. Zwierzęciu należy natychmiast podać dodatkowe znieczulenie poprzez zwiększenie stężenia środka znieczulającego.
   4. Zakryj oczy myszy niewielką ilością żelu okulistycznego, aby uniknąć wysuszenia oczu.
3. Zabiegu chirurgicznego
   1. Przetrzyj obszar chirurgiczny 3 razy alkoholową chlorheksydyną. Za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj proste nacięcie o długości 1 cm wzdłuż grzbietu, w odległości 3 mm od guza (ryc. 2A, 2B).
      nuta: Standaryzacja nacięcia do 1 cm u każdej myszy (za pomocą linijki) pozwala na równomierną ocenę gojenia się ran u myszy. Umiejscowienie nacięcia w odległości 3 mm od guza pozwala na późniejsze doguzowe leczenie uzupełniające bez wycieku z rany.
   2. Za pomocą pęsety odciągnij powięź i podskórną tkankę tłuszczową między guzem a otrzewną. Guz podskórny jest zwykle przyczepiony do strony skóry.
   3. Otwórz ranę, delikatnie przytrzymując skórę po stronie nośnej guza za pomocą pęsety i "odwróć" guz tak, aby był widoczny na zewnątrz (ryc. 2C, 2D).
      nuta: Fragment guza, który ma zostać usunięty, powinien znajdować się najbliżej otworu, aby mieć wystarczającą ilość skóry, aby zamknąć ranę. Uważaj, aby nie przeciąć skóry podczas usuwania guza.
   4. Za pomocą nożyczek odetnij torebkę nowotworową na pół, aby ją usunąć, zaczynając od podstawy guza znajdującej się najbliżej otworu.
   5. W przypadku 50% operacji debulk przeciąć w poprzek środka guza. Za pomocą zakrzywionych kleszczy zgarnij część guza, która ma zostać usunięta (50%); Zbierz wszelkie pozostałości z obszaru zdeluzowanego.
   6. W przypadku 75% debulkacji wykonaj 50% debulkację guza, jak w części 2.3.5 powyżej. Następnie przeciąć na pół pozostałe 50% guza i zgarnąć 25% guza za pomocą zakrzywionych kleszczy, jak opisano powyżej.
4. Zamykanie pola operacyjnego
   1. Umieść pozostały guz z powrotem pod skórą i za pomocą kleszczy ściągnij płaty skóry do siebie i wyrównaj skórę wzdłuż rany.
   2. Trzymaj skórę razem w odległości 5 mm od krawędzi rany i użyj klipsów chirurgicznych, aby zamknąć ranę, zaczynając od strony najbliższej kleszczy. Zastosuj tyle klipsów, ile potrzeba, aby upewnić się, że żadna tkanka pod spodem nie jest odsłonięta. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się od trzech do czterech klipsów z odstępami 2 mm między klipsami.
      nuta: Jeśli jakieś klipsy nie są dobrze zastosowane, usuń je za pomocą narzędzia do usuwania klipów i zastąp je nowymi klipsami.
5. Odzyskiwanie myszy
   1. Pozwól myszom dojść do siebie, umieszczając je w ciepłej (37 °C) komorze grzewczej.
   2. Umieść klatkę myszy na poduszce grzewczej. Monitoruj myszy w komorze grzewczej, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia (obudzą się i będą chodzić), a następnie umieść myszy z powrotem w klatce. Pozostaw klatkę na poduszce grzewczej na kolejne 10 minut, aż myszy staną się bardziej aktywne.
   3. Podawaj myszom mokre i miękkie jedzenie. Monitoruj myszy 1 godzinę po operacji pod kątem rekonwalescencji i upewnij się, że klipsy pozostają na swoim miejscu. Upewnij się, że klatka jest w połowie włączona/do połowy odsunięta od poduszki grzewczej, aby umożliwić zwierzętom samoregulację temperatury bez opieki.
   4. Podaj myszom 0,1 mg/kg buprenorfiny (100 μl podskórnie w kark szyi) 6-8 godzin po zabiegu (pod koniec dnia). Monitoruj myszy wcześnie następnego ranka i ponownie podaj im 0,1 mg/kg buprenorfiny (100 μl podskórnie w kark szyi). W razie potrzeby podawaj więcej mokrej karmy.
   5. Monitoruj myszy codziennie przez następne siedem dni. Klipsy można usunąć po siedmiu dniach za pomocą narzędzia do usuwania klipsów.
6. Leczenie uzupełniające lub neoadjuwantowe
   1. Leczenie myszy w okresie okołooperacyjnym terapią (neo)adjuwantową w dowolnym momencie, w zależności od interesującego ich leczenia.
   2. Na przykład potraktuj myszy jedną dawką 100 μg anty-CTLA-4 dootrzewnowo (i.p.) w 15 dniu po inokulacji lub trzema dawkami 200 μg anty-PD-1 i.p. w 15, 17 i 19 dniu po inokulacji.

Wyniki

Rycina 1: Reprezentatywne obrazy konfiguracji operacji.(A) Pełny obraz konfiguracji chirurgicznej przedstawiający narzędzia chirurgiczne (wymienione w kroku 2.1) i maszynę do znieczulania. (B) Migawka stołu chirurgicznego pokazująca wszystkie materiały w zasięgu ręki. (C) Komora grzewcza i poduszka grzewcza do odzyskiwania myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka insulinowa 26 G 0,5 ml	Becton Dickinson, Australia	326769	żaden
2-merkaptoetanol	Life Technologies Australia Sp. z o.o	21985023	żaden
Aparatura do gazów anestetycznych	Darvall weterynarz, Australia	Numer katalogowy: 2848	żaden
Anty-CTLA-4	BioXcell, Stany Zjednoczone	BE0164	żaden
Anty-PD-1	BioXcell, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał BP0273	żaden
Chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwań, 0,3 mg / ml	RB healthcare UK Limited, Wielka Brytania	Numer katalogowy: 55175	Zamówienie na receptę
Peeling chirurgiczny z chlorheksydyną 4%	Perigo Australia, Australia	CHL01449F(peeling	żaden
Surowica bydlęca płodu	CellSera, Australia	AU-FBS-PG	żaden
Kleszcze drobne 10,5 cm	Dom chirurgiczny, Australia Zachodnia	CC74110	żaden
Kleszcze drobne 12 cm ząbkowane	Dom chirurgiczny, Australia Zachodnia	CC74212	żaden
Kleszcze Halsted 14 cm	Dom chirurgiczny, Australia Zachodnia	CD01114	żaden
Komora grzewcza	Datesand Ltd, Wielka Brytania	Mini-Thermacage	żaden
HEPESY (1M)	Life Technologies Australia Sp. z o.o	15630080	żaden
Izofluran	Henry Schein Zdrowie Zwierząt, Australia	Numer katalogowy: 29405	Zamówienie na receptę
Nawilżająca maść do oczu	Alcon	N/a	żaden
Penicylina/streptomycyna 1000X	Life Technologies Australia Sp. z o.o	15140122	żaden
Roztwór buforowany fosforanem 10x	Life Technologies Australia Sp. z o.o	Nr kat. 70013-032	żaden
Klipsy Reflex 7mm	Zdolny naukowiec, Australia	AS59038	żaden
Refleksyjny aplikator z klipsem na rany 7 mm	Zdolny naukowiec, Australia	AS59036	żaden
Odruchowy środek do usuwania klipsów do ran	Zdolny naukowiec, Australia	AS59037	żaden
Obwód oddechowy anestezjologii gryzoni Qube	Darvall weterynarz, Australia	#7885	żaden
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamina	Life Technologies Australia Sp. z o.o	21870092	żaden
Nożyczki Irys STR 11 cm	Dom chirurgiczny, Australia Zachodnia	Zobacz materiał KF3211	żaden
Nożyczki Irys STR 9 cm	Dom chirurgiczny, Australia Zachodnia	Zobacz materiał JH4209	żaden
Mała komora indukcyjna	Darvall weterynarz, Australia	Numer katalogowy: 9630	żaden
TrypLE ekspresowy 1x	Life Technologies Australia Sp. z o.o	Numer katalogowy: 12604-021	żaden