Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przetwarzanie próbki ludzkiej skóry dawcy
UWAGA: Próbka ludzkiej skóry użyta w tym przeszczepie była dużą próbką pobraną z brzucha zdrowego pacjenta. Próbka musi mieć wymiary co najmniej 15 cm x 7,5 cm. Ograniczenia rozmiaru mogą mieć wpływ na liczbę myszy, dla których dostępna jest skóra, oraz na wybór rozmiaru przeszczepu.
- Utrzymuj próbkę skóry w niskich temperaturach (na lodzie; 4°C) przed przygotowaniem i szczepieniem. Utrzymuj próbkę wilgotną w zamkniętym kubku na próbki, z gazą nasączoną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
UWAGA: Nie zaleca się przechowywania próbki skóry w temperaturze 4 °C dłużej niż 2 dni. Istnieją jednak doniesienia, w których próbki skóry są przechowywane przez dłuższy czas.
ostrożność: Traktuj wszystkie ludzkie tkanki z zachowaniem standardowych środków ostrożności dotyczących zagrożeń biologicznych.
- Przygotuj się do dermatomizacji próbki ludzkiej skóry w wysterylizowanym kapturze do hodowli tkanek pod podciśnieniem na wysterylizowanej desce preparcyjnej.
- Umieść próbkę skóry naskórkiem do góry na desce preparcyjnej. Przetrzyj naskórek sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie PBS.
- Przypnij bliższą krawędź skóry za pomocą 1.5-calowego kołka do preparowania (patrz Tabela materiałów).
- Wykonaj dermatom próbki skóry o grubości 400 μm, wywierając stały nacisk, jednocześnie tnąc do przodu pod kątem 30°-45°. Postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami i środkami bezpieczeństwa specyficznymi dla przyrządu (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Szczegółowe informacje na temat techniki dermatomowej można znaleźć w wcześniej opublikowanym raporcie.
- Przygotować szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm, umieszczając na dnie naczynia sterylną gazę nasączoną sterylnym PBS. Połóż skórę naskórkiem do góry na mokrej gazie.
- Uszczelnić i przykryć krawędzie płytki półprzezroczystą folią uszczelniającą (patrz tabela materiałów), aby upewnić się, że próbka nie jest zanieczyszczona. Przechowywać próbkę w temperaturze 4°C przed szczepieniem.
2. Kondycjonowanie i przygotowanie przed operacją
- Przygotuj sterylne narzędzia i sterylną stację chirurgiczną do szczepienia. Używaj autoklawowanych ręczników papierowych jako sterylnych powierzchni do umieszczania instrumentów i myszy.
UWAGA: Myszy mogą być szczepione po odsadzeniu, ale najlepiej szczepić je w wieku 8-10 tygodni. Myszy obu płci mogą być szczepione.
- Przygotowanie chirurgiczne, takie jak depilacja, należy wykonać w obszarze fizycznie oddzielonym od stanowiska chirurgicznego.
- Przygotować anty-GR1 (patrz Tabela Materiałów), rozcieńczając go do 1 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Każdej myszy należy podać 100 μg/100 μl roztworu anty-GR1 dootrzewnowo po indukcji znieczulenia.
- Znieczulaj myszy, pojedynczo, izofluranem lub innymi instytucjonalnie zatwierdzonymi środkami znieczulającymi.
UWAGA: Izofluran musi być podawany w stężeniu 3%-5% podczas indukcji. Gdy mysz jest unieruchomiona, obniż stężenie izofluranu do 1%-3%, aby wpłynąć na czas trwania operacji.
- Monitoruj mysz pod kątem odpowiedniej głębokości znieczulenia, obserwując częstość oddechów, brak reakcji na szczypanie palców u nóg oraz odpowiednie różowe zabarwienie uszu i ust.
ostrożność: Używaj odpowiednich urządzeń znieczulających i metod oczyszczania oraz unikaj narażenia na opary izofluranu.
- Przenieś mysz na poduszkę grzewczą lub inne źródło ciepła (patrz Tabela materiałów).
- Maść okulistyczną należy podawać, wklepując niewielką kroplę maści w oko palcem w rękawiczce.
- Leki przeciwbólowe Buprenorfina (0,08 mg/kg) i karprofen (5 mg/kg) (patrz Tabela Materiałów) należy podawać podskórnie, ściskając skórę i wstrzykując pod kątem równoległym do ciała.
UWAGA: Przygotować analgezję przed leczeniem zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi wyboru i podawania leków przeciwbólowych. Metoda analgezji zastosowana w tym badaniu została przedstawiona w kroku 2.7 i na rycinie 1.
- Anty-GR1 (przygotowany w kroku 2.4) należy podawać dootrzewnowo, lekko unosząc mysz za ogon, odsłaniając brzuch i wstrzykując pod kątem 30° za pomocą strzykawki z insuliną o pojemności 1 ml (12,7 mm).
- Użyj bezpiecznych dla zwierząt elektrycznych maszynek do strzyżenia (patrz Tabela materiałów), aby ogolić środkową i górną część grzbietowej strony myszy.
- Oczyść wszystkie włosy i nałóż obfitą ilość maści do depilacji na ogoloną skórę na 30 s do 1 minuty.
- Całkowicie zetrzyj maść do depilacji ręcznikiem papierowym i PBS.
3. Procedura transplantacji
- Przenieś mysz do drugorzędnego miejsca chirurgicznego, z dala od stacji usuwania włosów.
- Wysterylizuj miejsce operacyjne patyczkiem do wymazów jodowych okrężnymi ruchami, zaczynając od środka i kierując się w stronę krawędzi depilowanego obszaru.
- Umieść kawałek sterylnej folii na myszy i wytnij okienko w plastiku nieco większe niż rozmiar obszaru, który ma być szczepiony.
- Wytnij prostokątną część skóry dawcy o wymiarach 10 mm x 10 mm, która ma zostać przeszczepiona skalpelem. Zrób to, mocno przytrzymując skórę dawcy na miejscu tylną stroną kleszczy i przecinając wzdłuż kleszczy skalpelem.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych odetnij prostokątny obszar skóry myszy pasujący do rozmiaru kawałka skóry dawcy, tworząc łoże przeszczepu. Użyj kleszczy, aby odciągnąć skórę od ciała i przetnij skórę nożyczkami pod kątem od ciała, aby uniknąć głębokiego cięcia twarzy.
- Umieść kawałek skóry dawcy, naskórkiem do góry, na przygotowanym łożu przeszczepu.
- Używając tylnej części kleszczy, manipuluj skórą, przesuwając się w przód iw tył, aż skóra dawcy będzie całkowicie płasko przylegać do łożyska przeszczepu.
- Dodaj krople kleju chirurgicznego, kleju tkankowego (patrz tabela materiałów) w miejscu, w którym skóra dawcy styka się ze skórą myszy i przytrzymaj skórę myszy i dawcy razem kleszczami przez 1-2 sekundy, aby klej przylegał do tkanek. Całkowicie uszczelnij krawędź przeszczepu i pozwól klejowi całkowicie wyschnąć.
- Zabandażuj myszy (Rysunek 2), wykonując poniższe czynności.
- Wytnij kawałek gazy wazelinowej (patrz Tabela materiałów) wystarczająco duży, aby całkowicie pokryć obszar przeszczepu.
- Przykryj przeszczep gazą wazelinową i lekko dociśnij gazę do skóry za pomocą kleszczy.
- Odetnij wzdłuż pasek przezroczystego opatrunku filmowego tak, aby szerokość była wystarczająco duża, aby zakryć ranę myszy.
- Mocno dociśnij przezroczysty opatrunk foliowy, samoprzylepną stroną do dołu, na gazę. Szybko obróć mysz, aby owinąć opatrunek całkowicie wokół tułowia, upewniając się, że ściśle przylega bez utrudniania oddychania, a wszystkie kończyny są wolne do ruchu.
- Umieść mysz w klatce odzyskiwania i monitoruj ją, aż będzie czujna i będzie się poruszać. Zapewnić źródło ciepła na części klatki na co najmniej 15 minut po odzyskaniu.
UWAGA: Oczekuje się, że zwierzęta wyzdrowieją w ciągu 1-5 minut po umieszczeniu ich w klatce ratunkowej.
