Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB. Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Ustanowienie modelu opartego na ludzkim PBMC
- Mieloablacja myszy NOD/SCID za pomocą cyklofosfamidu: określenie optymalnych dawek
- Kup samice myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) (6-8 tygodni).
nuta: Wszystkie myszy biorące udział w tym badaniu były samicami.
- Przygotować cyklofosfamid (CP) w różnych dawkach (50, 100 i 150 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej. Przygotować disulfiram (DS) w 0,8% Tween-80 w soli fizjologicznej w stężeniu 125 mg/kg.
UWAGA: Przygotowano różne stężenia CP, aby umożliwić podawanie równych objętości roztworu leku myszom otrzymującym różne dawki CP.
- Leczyć zwierzęta CP (dootrzewnowym, i.p.) i DS (okołoustnym, p.o.) raz dziennie przez 2 dni. Podać DS (p.o.) 2 godziny po każdej dawce CP.
UWAGA: DS zmniejsza urotoksyczność CP u myszy, a CP w połączeniu z DS sugeruje się dłuższą neutropenię niż zwierzęta leczone samym CP. Schemat dawkowania CP może wymagać wcześniejszego ustalenia przed faktycznymi badaniami i stwierdzono, że różni się nieznacznie między różnymi szczepami myszy z niedoborem odporności.
- Pobrać próbki krwi z zatoki żylnej oczodołu i przenieść do probówek pokrytych kwasem potasowym etylenodiaminotetraoctowym (EDTA-K) na lodzie w dniu 0 (1 h przed pierwszą dawką), w dniu 2 (24 godziny po drugiej dawce) i w dniu 4 (72 godziny po drugiej dawce).
- Zbadaj efekt mieloablacji po leczeniu CP i DS za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Użyj szczurzego anty-mysiego CD11b (M1 / 70), szczurzego anty-mysiego Ly6C (HK1.4) i szczurzego anty-mysiego Ly6G (1A8) do bramkowania CD11b + Ly6Cwysoko jako neutrofile, CD11b + Ly6Cwysoko jako monocyty.
- Rejestruj masę ciała i stan zdrowia myszy codziennie przez tydzień. Optymalna dawka CP i DS jest określana jako schemat, który powoduje maksymalne zubożenie neutrofili i monocytów bez powodowania ciężkiej toksyczności dla myszy.
- Przeszczep ludzkiego PBMC i wszczepienie guza: konfiguracja modelu
- Wyizolować ludzkie PBMC od zdrowych dawców przez wirowanie w gradionym przepływie gęstości zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wstępnie potraktuj myszy CP i DS, jak wskazano w krokach 1.1.2 i 1.1.3, aby zwiększyć skuteczność przeszczepu.
- 20 do 24 godzin po drugiej dawce CP i DS wstrzyknąć ludzką linię komórek nowotworowych, taką jak komórki A431 (ATCC, 2,5 x 106) i 5 x 106 izolowanych PBMC (zmieszanych w sumie 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 50% Matrigel) lub fragmenty guza (3 x 3 x 3 mm3, w całkowitej objętości 200 μl PBS zawierających 50% Matrigel) i 200 μL 5 x 106 PBMC (po 100 μl każdy po lewej i prawej stronie wszczepionego fragmentu guza) podskórnie (s.c.) w prawym boku zwierząt.
- Mierz objętość guza pierwotnego i zapisuj dwa razy w tygodniu przez 4-6 tygodni.
nuta: Myszy zostaną poddane eutanazji, gdy ich masa ciała spadnie o ponad 20% lub objętość guza osiągnie 2000 mm3 lub guz jest owrzodzony.
- Poddaj myszy eutanazji w komorach gazowych dwutlenkiem węgla. Zbierz całe tkanki nowotworowe u ofiarowanych myszy za pomocą nożyczek okulistycznych i przetwórz je do analizy histologicznej i immunohistochemicznej (IHC). Zbadaj ludzką ekspresję CD8, PD-1 i PD-L1 w tych tkankach.
