Hamowanie autofagii oparte na siRNA w niedojrzałych komórkach dendrytycznych zakażonych wirusem opryszczki pospolitej

Streszczenie

Źródło: Düthorn, A., et al. siRNA Electroporation to Modulation Autophagia in Herpes Simplex Virus Type 1-infected monocyt-based monocyt cells ( 2019).

Ten film demonstruje technikę opartą na małym interferującym RNA (siRNA) do zakłócania przepływu autofagicznego. SiRNA ukierunkowane na mRNA FIP200 jest wprowadzane do niedojrzałych komórek dendrytycznych (iDC) pochodzących z monocytów za pomocą elektroporacji, powodując obniżenie ekspresji FIP200 i prowadząc do zahamowania rozerwania laminy jądrowej poprzez autofagię. Po dodaniu wirusa opryszczki pospolitej (HSV) wychodzenie jądrowe potomstwa wirusa jest zahamowane z powodu braku rozerwania laminy przez strumień autofagiczny.

Protokół

DC pochodzące z monocytów zostały wygenerowane z produktów leukaferezy od zdrowych dawców. W tym celu uzyskano pozytywny głos lokalnej komisji etycznej (numer referencyjny 4556). Eksperymenty w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami komisji bioetycznej "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (numer referencyjny 4556). Wszyscy darczyńcy wyrazili pisemną świadomą zgodę, w tym zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Generowanie i obsługa niedojrzałych komórek dendrytycznych (iDCs) i dojrzałych komórek dendrytycznych (mDCs)

1. Wyizolować ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z komór systemu leukoredukcji (LRSC), jak opisano wcześniej. Unikaj kriokonserwacji PBMC i używaj ich bezpośrednio po izolacji, aby uzyskać wyższą wydajność prądu stałego.
2. Wygeneruj ludzkie DC z PBMC różnych zdrowych dawców w kolbach do hodowli komórkowych T175, jak opisano wcześniej. Krótko mówiąc, użyj 350-400 milionów PBMC w 30 ml pożywki DC (RPMI 1640 bez L-glutaminy, 1% (v/v) ludzkiej surowicy typu AB (surowica AB), 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 0,4 mM L-glutaminy, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)) na kolbę do hodowli komórkowej w celu izolacji monocytów przez przyleganie. Po 1 godzinie zmyć nieprzylegającą frakcję za pomocą RPMI 1640. Dodać świeżą pożywkę DC uzupełnioną 800 U/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i 250 U/ml interleukiny-4 (IL-4) i inkubować przez 3 dni.
   1. W 3 dniu po przyleganiu do zaleceń dodać 5 ml świeżej pożywki DC zawierającej GM-CSF i IL-4 o końcowym stężeniu odpowiednio 400 U/ml i 250 U/ml na kolbę do hodowli komórkowej w celu różnicowania DC.
   2. Aby zebrać iDC, delikatnie spłucz luźno przylegające iDC z dna kolby do hodowli komórkowej, w 4 dniu po przyklejeniu. Powtórz ten krok 2 razy. Do wytworzenia mDC dodać koktajl dojrzewający o następującym składzie: GM-CSF (stężenie końcowe: 40 U/ml), IL-4 (stężenie końcowe: 250 U/ml), interleukina-6 (IL-6, stężenie końcowe: 1000 U/ml), interleukina-1 beta (IL-1β, stężenie końcowe: 200 U/mL), czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α, stężenie końcowe: 10 ng/mL), prostaglandyna E2 (PGE2; stężenie końcowe: 1 μg/mL).
   3. Sześć dni po adherencji (dwa dni po indukcji dojrzewania za pomocą koktajlu cytokin) wypłukać mDC z dna kolby do hodowli komórkowej. Powtórz ten krok dwa razy.
      nuta: Niedojrzałe i dojrzałe DC mogą być sekwencyjnie generowane z identycznych dawców w 1 kolbie do hodowli komórkowych. W tym celu należy (i) oddzielić odpowiednią liczbę iDC i (ii) wywołać dojrzewanie pozostałych komórek w kolbach za pomocą koktajlu cytokin wymienionego w kroku 1.2.2.
3. Przenieść iDC lub mDC w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowej do probówek o pojemności 50 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 5 minut.
   1. Delikatnie zawiesić (=przepłukać) DC w 5-10 ml RPMI 1640 na kolbę do hodowli komórkowych. Połącz odpowiednie zawieszenia DC w jednej rurze.
   2. Zdefiniuj numer komórki za pomocą komory zliczającej lub metody alternatywnej. Unikaj zmian temperatury podczas obchodzenia się z iDC, aby zmniejszyć ryzyko zmian fenotypowych.

2. Analizy cytometryczne przepływu w celu monitorowania stanu dojrzewania fenotypowego

1. Przenieś iDC lub mDC (0.5 x 10⁶) z kroku 1.3.1 do probówki 1.5 mL. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3390 x g przez 1,5 min. Przemyć komórki raz buforem FACS (PBS uzupełniony 2% płodową surowicą cielęcą (FCS)).
2. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu barwiącego przeciwciała (bufor FACS) zawierającego specyficzne przeciwciała znakowane fluorochromem przeciwko określonym cząsteczkom powierzchniowym.
   1. Użyj następujących przeciwciał, aby zweryfikować czystość (CD3- izotiocyjanian fluoresceiny [FITC], CD14- fikoerytryna [PE]), a także stan dojrzewania DC (CD80-PacBlue [Pacific Blue]/-PE- cyjanina5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. Przygotować jedną niebarwioną próbkę w 100 μl buforu FACS jako kontrolę.
   3. Plamić komórki na lodzie w ciemności przez 30 minut.
3. Następnie przemyć komórki dwa razy w 1 ml buforu FACS i odwirować przy 3390 x g przez 1,5 minuty.
4. Na koniec ponownie zawieś komórki w 200 μl buforu FACS uzupełnionego 2% paraformaldehydem (PFA) i przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Stałe ogniwa można przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności do 2 dni.

3. Interferencja strumienia autofagicznego indukowanego przez HSV-1 poprzez elektroporację iDC przy użyciu FIP200-siRNA

UWAGA: Obecny protokół elektroporacji siRNA został zmodyfikowany z Prechtel et al. (2007) i Gerer et al. (2017).

1. Przenieść iDC (12 x 10⁶) w 3,5 dniu po przyklejeniu do probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwirować komórki o stężeniu 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Równolegle należy przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej w celu monitorowania stanu dojrzewania zgodnie z opisem w kroku 2 (Użyj fioletu Life/Dead zamiast CD80-PacBlue).
2. Delikatnie przemyć iDC w 5 ml OptiMEM bez czerwieni fenolowej i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i delikatnie ponownie zawiesić iDC w 200 μl OptiMEM bez czerwieni fenolowej, dostosowując stężenie komórek 6 x 10⁶/100 μL. Nie umieszczaj ogniw na lodzie i unikaj zmian temperatury. Działaj szybko i unikaj długich okresów inkubacji iDC w OptiMEM bez czerwieni fenolowej.
3. Przenieść 75 pmol siRNA specyficznego dla FIP200 lub 75 pmol zaszyfrowanego siRNA, jako kontrolę, do 4 mm elektrokuwet i dodać 100 μl (6x10⁶ komórek) zawiesiny komórki. Bezpośrednio impulsować iDC za pomocą aparatu do elektroporacji I, stosując następujące ustawienia: 500 V przez 1 ms.
   1. Przed rozpoczęciem procedury doświadczalnej należy przygotować zawiesiny siRNA zgodnie z instrukcją producenta, podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić i przechowywać na lodzie w przypadku używania tych siRNA do elektroporacji. Przed elektropoturą próbek należy wykonać impuls testowy.
4. Po elektroporacji bezpośrednio przenieś iDC na płytki 6-dołkowe ze świeżym, wstępnie podgrzanym podłożem DC (uzupełnionym 40 U/ml GM-CSF i 250 U/ml IL-4). Wysiewać komórki w końcowym stężeniu 1 x 10⁶/ml i umieszczać je w inkubatorze. Nie wypłukuj ogniw z kuwety elektrycznej.
5. Po 48 godzinach najpierw zbadaj pod mikroskopem morfologię elektroporowanych iDC. Następnie zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do probówek o pojemności 15 ml. Przepłukać studzienki 1 ml PBS uzupełnionego 0,01% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i przenieść roztwór do odpowiednich probówek.
6. Następnie podziel 6 x 10⁶ iDC na warunek siRNA, jak opisano w następnych krokach.
   1. Użyj komórek 0,5 x 10⁶, aby ocenić stan dojrzewania i żywotność komórek, jak opisano w kroku 2. Należy stosować następujące przeciwciała: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 i Life/Dead violet.
   2. Użyj 1 x 10⁶ komórek do analiz Western blot, aby zweryfikować skuteczność knockdown specyficzną dla FIP200. Przenieś i zbierz komórki do probówki safelock o pojemności 1,5 ml przez odwirowanie przy 3390 x g przez 1,5 minuty. Przygotuj lizaty komórkowe i wykonaj analizę Western blot.
   3. Użyj pozostałych komórek (4,5 x 10⁶) do eksperymentów z infekcją HSV-1. Dla każdego warunku eksperymentalnego przenieś 2,25 x 10⁶ iDC do probówek o pojemności 2 ml i albo zainfekuj je HSV1 przy wielokrotności infekcji (MOI) 2, albo dodaj bufor MNT jako pozorowaną kontrolę. Wykonaj infekcję zgodnie z opisem.
   4. Po 20 godzinach od zakażenia (hpi) należy pobrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przygotować lizaty komórkowe do analizy Western blot.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jednostka rdzeniowa 4D-Nucleofector (aparat do elektroporacji II)	Lonza (Bazylea, Szwajcaria)	AAF-1002B
Serum AB	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)	Zobacz materiał H4522	Hodowla komórek dendrytycznych
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)	9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (aparat do elektroporacji II)	Lonza (Bazylea, Szwajcaria)	V4XP-3024
Odczynnik do wykrywania Western Blotting Amersham ECL Prime	GE Healthcare (Solingen, Niemcy)	RPN2232	Wykrywanie Western Blot
Nadsiarczan amonu (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)	A3678
anty-mysie IgG (mysie, poliklonalne, HRP)	Sygnalizacja komórkowa (Leiden, Holandia)	Zobacz materiał 7076	Wykrywanie Western Blot
anty-królicze IgG (kozie, poliklonalne, HRP)	Sygnalizacja komórkowa (Leiden, Holandia)	Zobacz materiał 7074	Wykrywanie Western Blot
Cytometr przepływowy BD FACS Canto II	BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)	338962
Komora bibułkowa Fastblot B44	Biometra (Getynga, Niemcy)	846-015-100
CCR7 (mysz, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, Niemcy)	557648	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:100 Klon: G043H7
CD11c (mysz, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)	561692	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:100 Klon: B-ly6
CD14 (mysz, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)	555398	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:100 Klon: M5E2
CD3 (mysz, FITC)	BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)	555332	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:100 Klon: UCHT1
CD80 (mysz, V450)	BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)	560442	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:100 Klon: L307.4
CD83 (mysz, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Niemcy)	Numer katalogowy: 17-0839-41	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:200 Klon: HB15e
CD86 (mysz, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Niemcy)	553692	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:100
Obrazowanie komórek EVOS FL	System AMG/Life Technologies (Karlowe Wary, Stany Zjednoczone)	AMF4300
FIP200 (królik)	Sygnalizacja komórkowa (Leiden, Holandia)	Numer katalogowy: 12436	Wykrywanie Western Blot Rozcieńczenie: 1:1000 Klon: D10D11
Aparat Gene Pulser II (aparat do elektroporacji I)	BioRad Laboratories GmbH (Monachium, Niemcy)	165-2112
GM-CSF (4x104 U/ml)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)	130-093-868
HLA-DR (mysz, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, Niemcy)	307618	Cytometria przepływowa Rozcieńczenie: 1:200 Klon: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BioVex (Zielony)		Zakażenie prądem stałym
IL-1β (0,1x106 U/ml)	Cell Genix GmbH (Fryburg Bryzgowijski, Niemcy)	1411-050
IL-4 (1x106 U/ml)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)	Numer katalogowy: 130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Fryburg Bryzgowijski, Niemcy)	Numer katalogowy: 1404-050
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (Solingen, Niemcy)	28955810
L-glutamina	Lonza (Bazylea, Szwajcaria)	17-605E
LIVE/DEAD Naprawialny fioletowy zestaw do barwienia martwych komórek	Life Technologies (Karlowe Wary, Kalifornia, Stany Zjednoczone)	L34964	Barwienie L/D w cytometrii przepływowej
Preparat limfatyczny	Alere Technologies AS (Oslo, Norwegia)	04-03-9391/01
Chlorek magnezu	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)	Zobacz materiał A537.1
Megafuge 2.0 RS	Heraeus (Hanau, Niemcy)	75015505
Komora licząca Neubauera	Marka (Wertheim, Niemcy)	717805
Nunc Kolby do hodowli komórkowych (175,0 cm2)	Thermo Scientific (Rockford, Stany Zjednoczone)	Numer katalogowy: 159910
Paraformaldehyd, 16 %	Alfa Aesar, Haverhill, Stany Zjednoczone	43368.9 mln
PerfectSpin 24 Plus	Peqlab (Erlangen, Niemcy)	Zobacz materiał C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/ml)	Pfizer (Berlin, Niemcy)	BE130681
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Lonza (Bazylea, Szwajcaria)	17-512F
Bufor do usuwania plam Western Blot RestoreTM	Thermo Scientific, Rockford, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 21059
Platforma bujana wt 15	Biometra (Getynga, Niemcy)	Numer katalogowy: 042-590
Blok RotiBlock	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)	Klasa robocza A151.4
Obciążenie rotacyjne 1 (4x)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)	Zobacz materiał K929.3
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)	3029.1
Silnik RPMI 1640	Lonza (Bazylea, Szwajcaria)	12-167F
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)	2326.2
Komfort termomiksera	Eppendorf (Hamburg, Niemcy)	5355 000.011
TNF-α (10 μg/ml)	Peprotech (Hamburg, Niemcy)	300-01A
Tris	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)	4855.3
Roztwór błękitu trypanowego (0,4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy)	Zobacz materiał T8154
Animacja 20	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Niemcy)	9127.1
Membrana nitrocelulozowa Whatman 0,2 μm	GE Healthcare (Solingen, Niemcy)	10600001
Bibuła chromatograficzna WhatmanTM 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Niemcy)	3030917

(wersja angielska) TGL TGL TGL