Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zwierzęta
- Hoduj samice myszy C57BL6/J do 8 tygodnia życia w indywidualnie wentylowanych klatkach z filtrami mikroizolacyjnymi.
UWAGA: Preferowane są kobiety, ponieważ anatomiczna budowa ich zewnętrznego aparatu moczowo-płciowego sprawia, że cewnikowanie jest łatwiejsze niż u mężczyzn.
2. Hodowla komórkowa
- Utrzymuj linię komórkową raka urotelialnego myszy MB49 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 50 μg/ml gentamycyny w temperaturze 37 °C w nawilżonym 5% dwutlenku węgla (CO2).
- Hoduj komórki MB49 w kolbach T-75 do 80% konfluencji. Trypsynizować i ponownie zawiesić w 0,5 × 105 - 0,5 × 106 komórek na 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przed implantacją u myszy.
3. Implant guza dopęcherzowego
- Myszy należy znieczulić za pomocą mieszanki środków znieczulających zoletil i ksylor (odpowiednio 33 mg/kg i 20 mg/kg), wstrzykiwanych dootrzewnowo.
- Ułóż zwierzęta w pozycji leżącej na plecach i przymocuj tylne nogi do podkładki za pomocą taśmy klejącej. Łapy muszą być wystarczająco oddzielone, aby przewód moczowy był dobrze widoczny i łatwo dostępny do wprowadzenia cewnika.
- UWAGA: Do cewnikowania pediatryczny cewnik żylny 24 G jest odpowiedni dla myszy w wieku od 8 do 10 tygodni. Wybór cewnika ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć wycieku płynu między ścianą cewki moczowej a cewnikiem. W przypadku większych lub starszych myszy należy używać cewników o większym otworze.
- Za pomocą małego szczypiec ściśnij jedną krawędź zewnętrznej części cewki moczowej i przekręć ją bardzo delikatnie w kierunku "końca głowy" myszy. Działanie to odsłania ujście cewki moczowej.
- Wyjmij wewnętrzną igłę cewnika i włóż ją do cewki moczowej pod kątem 45°, lekko zorientowaną w kierunku "końca ogona" myszy. Nie należy wciskać cewnika na siłę; W przypadku oporu wystarczy bardzo delikatnie przekręcić cewnik, aż wsunie się do cewki moczowej. Gdy około 0,5-0,8 cm cewnika znajdzie się w cewce moczowej, ostrożnie umieść cewnik równolegle do ogona myszy i włóż go całkowicie.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, której igłę należy wprowadzić do cewnika, należy umyć pęcherz moczowy z zalegającego moczu, wstrzykując 200-300 μl jałowego PBS i odessać cały płyn z pęcherza.
- UWAGA: Podczas wstrzykiwania PBS pęcherz wypełni się, a obrzęk będzie widoczny między tylnymi nogami myszy; potwierdza to, że cewnikowanie jest prawidłowe. Większość cewników ma objętość martwą, którą należy wziąć pod uwagę przy obliczaniu objętości wstrzyknięcia.
- Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć 200 μl 0,1 N kwasu solnego (HCl). Napełnij pęcherz, aby spalić całą jego ścianę. Po 10 sekundach usunąć cały kwas i natychmiast zneutralizować, wstrzykując 200 μl 0,1 N wodorotlenku sodu (NaOH) za pomocą sterylnej strzykawki. W przypadku wstrzyknięcia największej liczby komórek (0,5 × 106) etap zakwaszania nie jest wymagany.
- Odessać cały pozostały płyn i natychmiast przepłukać jamę 300 μl sterylnego PBS.
- Opróżnić pęcherz moczowy przez aspirację i wstrzyknąć 150 μl PBS zawierającego komórki MB49 (zakres 0,5 × 105 - 0,5 × 106) do pęcherza moczowego. Pozostawić strzykawkę zmontowaną do cewnika, aby uniknąć wycieku komórek. Lepiej jest zabezpieczyć strzykawkę, mocując ją do podkładki za pomocą taśmy klejącej.
- Po 1 godzinie delikatnie wyjmij cewnik z cewki moczowej i umieść myszy w klatce pod żarówką, aż się obudzą: zwykle następuje to między 1 a 2 godziną po zakończeniu leczenia.
4. Dopęcherzowe dostarczanie białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori (HP-NAP)
- UWAGA: Co najmniej 3 dni po wkropleniu komórek można rozpocząć kurację.
- Cewnikować zgodnie z opisem w krokach od 3.1 do 3.4. Na tym etapie nie jest konieczne spalanie ściany pęcherza HCl.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml umyj pęcherz moczowy z resztek moczu, wstrzykując 200-300 μl sterylnego PBS i odessać cały płyn z pęcherza.
- Wstrzyknąć 50 μg HP-NAP na 150 μl PBS do pęcherza moczowego. Pozostawić strzykawkę podłączoną do cewnika, aby uniknąć wycieku roztworu białka. Zabezpieczyć strzykawkę, przymocowując ją do podkładki za pomocą taśmy klejącej.
- Po 1 godzinie delikatnie wyjmij cewnik z cewki moczowej i umieść myszy w klatce pod żarówką, aż się obudzą.
