$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez local
instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjna komisja rewizyjna JoVE. Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Wytwarzanie wirusowych limfocytów T CD8+ specyficznych dla Ag z limfocytów T iPSC (limfocyty T iPSC-CD8+)
- Tworzenie konstruktów retrowirusowych
nuta: Geny α i β receptora limfocytów T (TCR) są połączone sekwencją samorozszczepiającą 2A. Wektor retrowirusowy MSCV-IRES-DsRed (MiDR) to DsRed+.
- Subklonuj specyficzne dla HBs183-191 (FLLTRILTI) geny TCR (s183 TCR) ludzko-mysiej hybrydy ludzko-mysiej (s183 TCR) (Vα34 i Vβ28) do MiDR, aby utworzyć konstrukt MiDR s183 (Figura 1A).
- Transdukcja retrowirusowa
UWAGA: Komórki Platinum-E (Plat-E) są używane do pakowania retrowirusów (przenoszących geny s183 TCR), które będą używane do transdukcji retrowirusowej. Komórki Plat-E są skutecznymi komórkami pakowania retrowirusów leżącymi u podstaw komórek 293T, które zostały opracowane za pomocą unikalnych konstruktów pakowania za pośrednictwem promotora EF1α do ekspresji białka struktury retrowirusowej, w tym GAG, Pol i ekotropowego env.
- Na naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm wysiać 3 x 106 komórek Plat-E w 8 ml pożywki hodowlanej DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 1 dzień przed transfekcją.
- W dniu 0 transfekuj konstrukt MiDR s183 do komórek Plat-E za pomocą odczynnika do transfekcji DNA.
- W dniu 1 wysiewaj 1 x 106 iPSC (zielone białko fluorescencyjne [GFP]+) na wstępnie pokrytą żelatyną płytkę hodowlaną.
- W dniach 2-3 należy pobrać supernatant zawierający retrowirusy z hodowli komórkowej Plat-E w celu transdukcji iPSC za pomocą TCR s183 w obecności roztworu 1,6-dibromoheksanu.
- W dniu 4 trypsynizować iPSC transdukowane genem s183 TCR, wirować przy 400 x g przez 5 minut i wysiewać 3 × 105 iPSC w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm wstępnie pokrytym 3 x 106 napromieniowanymi komórkami zasilającymi SNL76/7 (irSNL76/7).
- W 5 lub 6 dniu konfluencji trypsynizuj komórki, odwiruj przy 400 x g przez 5 minut i poddaj sortowaniu komórek. Bramkowanie na żywych komórkach sortuje podwójnie dodatnie komórki GFP i DsRED (iPSC transdukowane genem s183 TCR) za pomocą szybkiego sortownika komórek. Podobnie jak w kroku 1.2.5, należy przeprowadzić wspólną hodowlę posortowanych komórek na komórkach zasilających irSNL76/7 do wykorzystania w przyszłości.
- Różnicowanie limfocytów T iPSC-CD8+ swoistych dla HBV
UWAGA: Komórki zrębu OP9-DL1 / DL4 nadmiernie eksprymują zarówno ligandy Notch DL1, jak i DL4, a współhodowla iPSC z iPSC może promować różnicowanie limfocytów T za pośrednictwem sygnalizacji Notch.
- Hoduj transdukowane genem s183 TCR iPSC (s183 / iPSC) w monowarstwie komórek OP9-DL1-DL4 w pożywce o minimalnej α niezbędnej pożywce (MEM) zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Włączyć do hodowli mysi ligand kinazy tyrozynowej 3 (Flt3) podobny do FMS (mFlt-3L; stężenie końcowe = 5 ng / ml).
- W dniu 0 wysiewaj 0,5–1,0 x 105 S183/iPSC w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym wcześniej wyhodowanym z komórkami OP9-DL1-DL4. Sprawdź, czy komórki OP9-DL1-DL4 są w stanie konfluencji 80%–90%.
- W 5 dniu przepłucz iPSC 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), odessaj PBS, dodaj ją do 4 ml 0,25% trypsyny i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 10 minut. Następnie dodaj dodatkowe 8 ml pożywki iPSC, aby zakończyć trawienie trypsyny. Zebrać wszystkie roztwory trawienne zawierające komórki i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 15–30 °C.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki iPSC. Przenieść zawiesinę komórek na nową 10 cm płytkę Petriego i inkubować w inkubatorze przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Po 30 minutach zebrać pożywkę iPSC zawierającą pływające komórki. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm i obliczyć liczbę komórek.
- Zasiew: 5 x 105 komórek w naczyniu hodowlanym wcześniej wyhodowane komórki OP9-DL1-DL4 w stanie zlewania się 80%–90%, jak opisano w kroku 1.3.1.
nuta: W celu różnicowania limfocytów T, co 2-3 dni, komórki pochodzące z iPSC muszą ponownie zasiać się świeżą warstwą komórek OP9-DL1-DL4.
- ocena
- Zmiany morfologiczne różnicujących się iPSC
- Obserwuj komórki pod mikroskopem w różne dni.
nuta: Do 5 dnia kolonie mają cechy podobne do mezodermy, wykazując klasyczną morfologię w kształcie wrzeciona przypominającą ludzkie fibroblasty skóry i trwały wzrost in vitro. W 8 dniu zaczynają pojawiać się małe okrągłe skupiska komórek.
- Analiza różnicowania iPSC za pomocą cytometrii przepływowej
- W różnych dniach kohodowli analizuj komórki pochodzące z iPSC, jak opisano wcześniej (Figura 1B, C).
- Analiza funkcjonalna różnicowania iPSC
- W 28 dniu kohodowli należy pobrać limfocyty T iPSC-CD8 + z hodowli, zbierając pływające komórki, trypsynizować pozostałe komórki 0,25% trypsyny, ponownie zawiesić w 8 ml pożywki iPSC, wirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g w temperaturze 15–30 °C, usunąć pożywkę, a następnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki.
- Ponownie zawieszone komórki należy przechowywać w świeżym naczyniu o średnicy 10 cm w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut i zmontować pływające komórki. Następnie przepłucz komórki jeden raz zimnym PBS.
- Inkubować 3 x 10 6 splenocytów zubożonych w limfocyty T (CD4-CD8-) ze śledziony z nokautem H-2 klasy I, myszy transgenicznych HLA-A2.1 (HHD) z peptydem 5 μM s183 (FLLTRILTI) w 200 μL pożywki w temperaturze 4 °C przez 30 min.
- Wyprodukuj mieszaninę limfocytów T iPSC-CD8 + ze splenocytami pulsującymi peptydem s183 (limfocyty T: splenocyty = 1:4; użyj 0,75 x 106 limfocytów T). Mieszaninę komórek inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 przez 40 godzin. W ciągu ostatnich 7 godzin dodać 4 μl rozcieńczonej brefeldyny A do kultury (końcowe stężenie 1,000x, które zostanie rozcieńczone w 1x pożywce hodowlanej) w celu zablokowania procesów transportowych podczas aktywacji komórek.
- Wybarwić komórki i przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową wewnątrzkomórkowego interferonu gamma (IFN-γ), jak opisano wcześniej (ryc. 2).
2. Indukcja replikacji HBV poprzez hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV
UWAGA: konstrukcja pAAV/HBV1.2 została wygenerowana zgodnie z wcześniejszym opisem. Kompletne DNA HBV 1.2 jest włączone do wektora pAAV.
- Hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV przez żyłę ogonową
- Ogrzewaj myszy HHD za pomocą lampy grzewczej przez 5 minut w klatce, aby rozszerzyć żyłę ogonową.
- Zatrzymaj zwierzę za pomocą krępa i wyczyść ogony myszy sprayem 70% etanolu.
- Dostarczanie plazmidu do wątroby.
- Zmierz masę ciała myszy za pomocą skali miary.
- Rozcieńczyć 10 μg plazmidu HBV w 8% równoważniku masy ciała PBS (np. 1,6 ml na 20 g myszy). Załadować rozcieńczony plazmid do strzykawki o pojemności 3 ml za pomocą igły podskórnej o gramaturze 26 G × 1⁄2" (0,45 × 12 mm).
- Zlokalizuj jedną z dwóch bocznych żył ogonowych w środkowej jednej trzeciej ogona i umieść igłę w dowolnej żyle bocznej. Wstrzyknięcie zawierające plazmid HBV należy podać przez żyłę ogonową w ciągu 3 - 5 sekund.
- Kwantyfikacja wiremii z surowicy krwi zakażonych myszy
nuta: Replikacja HBV zachodzi od 3 do 35 dnia w surowicy myszy. Replikacja DNA osiąga szczyt w 7 dniu i stopniowo się zmniejsza. DNA HBV nie jest usuwane z surowicy aż do 35 dnia.
- Pobieranie surowicy krwi od zakażonych myszy
- Zebrać około 0,1 ml krwi w probówce mikrowirówkowej od każdej myszy przez 3, 5, 7 i 10 dni po zakażeniu przez krwawienie zaoczodołowe w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
- Odwirować próbkę o masie 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i po odwirowaniu zebrać supernatant surowicy.
- Oczyść DNA z surowicy krwi za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z zaleceniami producenta. Krótko mówiąc, poddać lizie komórki w kolumnie na bazie krzemionki, przeprowadzić płukanie i wyekstrahować DNA, dodając 100% etanolu do kolumny elucyjnej i odwirowując przy 6000 x g przez 1 min. Eluuj DNA w 50 μl wody wolnej od RNaz.
- Użyj 100 ng DNA HBV z elucji do analizy PCR w czasie rzeczywistym. Użyj następujących starterów i sond: forward 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; rewers 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- Użyj genomu HBV zawierającego plazmid (pAAV / HBV1.2) dla krzywej standardowej i wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w całkowitej objętości 10 μL (Figura 3).
- Ustawić reakcję PCR w całkowitej objętości 10 μl, jak pokazano w Tabeli 1.
- Skonfiguruj program PCR w termocyklerze, jak pokazano w Tabeli 2. Zaprogramowana szybkość zmiany temperatury wynosi 20 °C/s dla denaturacji/wyżarzania i 5 °C/s dla przedłużenia. Zmierz fluorescencję na końcu fazy wyżarzania dla każdego cyklu w celu monitorowania PCR w czasie rzeczywistym.
3. Redukcja replikacji HBV przez ACT wirusowych limfocytów T iPSC-CD8+ specyficznych dla Ag
- Adoptywny transfer komórek (ACT)
- Różnicować s183/iPSC (1.3.7) na komórkach zrębu OP9-DL1-DL4 w obecności mFlt-3L i mIL-7 przez 8 dni, jak opisano w sekcji 1.3.
- W 22 dniu należy pobrać limfocyty T iPSC-CD8+ z 10-centymetrowej płytki za pomocą trypsyny, a następnie umyć i ponownie zawiesić każdą 10-centymetrową płytkę w 10 ml świeżej pożywki. Dodać komórki do świeżej płytki o średnicy 10 cm i ponownie umieścić w inkubatorze na 30 minut, jak to opisano w sekcji 1.3. Po 30 minutach zbierz pływające komórki.
- Użyj nylonowego sitka o średnicy 70 μm, aby przepuścić komórki, wyeliminować skupiska komórek i policzyć liczbę komórek. Dostosuj komórki do stężenia 1,5 x 107 komórek/ml w zimnym roztworze PBS i użyj nylonowego sitka o średnicy 70 μm do przepuszczenia komórek, aby w razie potrzeby ponownie wyeliminować skupiska komórek. Utrzymuj komórki na lodzie aż do ACT.
- Wstrzyknij 200 μl zawiesiny komórek (3 x 106 komórek) 4-6 tygodniowym myszom HHD przez żyłę ogonową.
- Indukcja replikacji HBV
- W 14 dniu po transferze komórek należy przeprowadzić hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV przez żyłę ogonową, jak opisano w punkcie 2.1.
Tabela 1: Objętość reakcji PCR
| Matryca DNA | Pojemność 2 ml |
| Mieszanina do hybrydyzacji DNA master ((polimeraza DNA Taq, bufor reakcyjny PCR, 10 mM MgCl2 i mieszanina dNTP) | Pojemność 1 ml |
| 25 mM MgCl2 | Pojemność 0,8 ml |
| 0,3 μM sondy | Pojemność 3 ml |
| 5 μM każdego podkładu | 3,2 ml |
| łączny | Pojemność 10 ml |
Tabela 2: Program PCR
| denaturacja | Temperatura
95 °C | Czas
5 sekund |
| Wyżarzanie | 53 °C | 10 sekund |
| rozszerzenie | 72 °C | 20 sekund |
| 5 °C | |
