Terapia komórkowa autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Haque, M. et al., Rozwój komórek T regulatorowych specyficznych dla antygenu komórek macierzystych przeciwko autoimmunizacji.J. Vis. Exp. (2016)

Ten film prezentuje terapię komórkową autoimmunologicznego zapalenia stawów u myszy. Komórkom regulatorowym T pochodzącym z iPSC, wyrażającym receptory specyficzne dla albuminy jaja kurzego, wstrzykuje się metylowaną albuminę surowicy bydlęcej (mBSA) emulgowaną w adiuwancie. Mysie komórki prezentujące antygen (APC) przetwarzają i prezentują mBSA limfocytom T, wywołując aktywację limfocytów T i migrację do błony maziowej stawu kolanowego. Kolejne wstrzyknięcia obejmują samo mBSA w lewym kolanie i kombinację mBSA i albuminy jaja kurzego w prawym kolanie. W lewym kolanie odpowiedź immunologiczna na mBSA wywołuje zapalenie stawów, podczas gdy w prawym kolanie komórki T-regulatorowe oddziałujące z albuminą jaja kurzego łagodzą stan zapalny, łagodząc objawy zapalenia stawów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Dojrzewanie in vivo i tłumienie autoimmunologicznego zapalenia stawów

1. Wygeneruj konstrukty do wykorzystania w transdukcji retrowirusowej poprzez subklonowanie genów receptora komórek T OT-II (TCR) i białka forkhead box 3 (FoxP3) do plazmidu MiDR połączonego z samorozszczepiającym się peptydem 2A, aby utworzyć konstrukt MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Wykonaj transdukcję retrowirusową indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu komórek Plat E jako linii komórek pakujących.
3. Różnicowanie in vivo i indukcja zapalenia stawów u myszy.
   1. Różnicować iPSC transdukowane przez OT-II TCR / FoxP3 (OT-II-FoxP3 / iPSC), iPSC transdukowane FoxP3 i iPSC transdukowane DsRed na komórkach zrębu b OP9-DL1-DL4-I-A b w obecności cytokin mFlt-3L i mIL-7 przez 8 dni.
   2. W dniu 0 wysiewaj komórki^b OP9-DL1-DL4-I-A o minimalnej gęstości 10⁴ komórek/cm² przy użyciu pożywki OP-9 (pożywki α-MEM zawierające 20% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 2,2 g / l wodorowęglanu sodu. Talerz 1 x 10⁶ komórek na 10 cm naczynie.
   3. W 3 dniu, gdy komórki^b OP9-DL1-DL4-I-A stają się zlewające w 80-90%, usuń pożywkę i zasiej 0,5 - 1 x 10⁵ komórek iPS na komórkach^b OP9-DL1-DL4--I-A w pożywce OP-9.
      UWAGA: Ustanawia to kokulturę iPSC na komórkach^b OP9-DL1-DL4-I-A i jest uważane za dzień 0 różnicowania.
   4. W dniu 5 wyjąć pożywkę z 10 cm naczynia przez aspirację, przemyć komórki 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odessać PBS. Dodać 4 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Dodać kolejne 8 ml pożywki iPSC do komórek, ponownie je zawiesić i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki iPSC. Ponownie zawieszone komórki inkubować na świeżym 10 cm naczyniu i ponownie umieścić w inkubatorze przez 30 minut.
         UWAGA: Usuń ogniwa zasilające OP9-DL1-DL4-I-A^b i zachowaj różnicujące się iPSC w pożywce. Utrzymuj limfocyty^B OP9-DL1-DL4-I-A w sposób ciągły, aby osiągnąć 80 - 90% konfluencji dla dalszej kohodowli.
      2. Po 30 minutach zbierz pływające komórki, przefiltruj je przez sitko o wielkości 70 μm i policz je hemocytometrem.
   5. Zasiewaj 5 x 10⁵ iPSC do świeżego 80-90% konfluentu komórek^b OP9-DL1-DL4-I-A w pożywce OP9. Uzupełnij pożywkę mFlt-3L w końcowym stężeniu 5 ng/ml.
   6. Trypsynizować wszystkie trzy rodzaje komórek z płytki o średnicy 10 cm i ponownie zawiesić komórki z każdej płytki o średnicy 10 cm w 10 ml świeżej pożywki. Dodaj komórki do świeżej płytki o średnicy 10 cm i wróć do inkubatora na 30 minut. Po 30 minutach zbierz pływające komórki.
   7. Przepuść komórki przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć skupiska komórek i policzyć za pomocą hemocytometru. Dostosuj komórki do stężenia 1,5 x 10⁷ komórek/ml w zimnym PBS i ponownie przefiltruj w razie potrzeby. Utrzymuj komórki na lodzie, aż adoptywne przeniesienie komórek do myszy.
   8. Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórkowej (3 x 10⁶ komórek) trzem różnym grupom 4-6 tygodniowych samic myszy C57BL/6 przez żyłę ogonową.
   9. W 10 dniu, po transferze komórek, wstrzyknąć myszom 100 μg metylowanej albuminy surowicy bydlęcej (mBSA) zemulgowanej w kompletnym adiuwant Freunda u podstawy ogona za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
   10. W 17 dniu znieczulij myszy za pomocą waporyzatora izofluranowego. Stosować 4 - 5% izofluranu do indukcji i 1 - 2% do konserwacji. Wywołać zapalenie stawów poprzez dostawowe wstrzyknięcie 20 μg mBSA w 10 μl PBS w lewym stawie kolanowym oraz 20 μg mBSA i 100 μg całej albuminy jaja kurzego (OVA) w 10 μl PBS w prawym stawie kolanowym. Jedzenie i okład żelowy można położyć na podłodze pościeli po rozwinięciu się zapalenia stawów. Myszy zostaną poddane eutanazji: Ocena kondycji ciała (BCS) 2/5 lub w stanie agonalnym, ciężka kacheksja i/lub uporczywe leżenie (okres 24 godzin) oraz ocena ciężkości 4. W wyniku 4 rumień i silny obrzęk obejmują kostkę, stopa i palce lub zesztywniacze kończyny.
4. Charakterystyka iPSC transdukowanych przez OT-II TCR/FoxP3.
   1. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego (20X), aby uwidocznić nieutrwalone żywe komórki DsRed⁺ GFP⁺.
   2. Zbadaj integrację i ekspresję genów zarówno za pomocą Western blot, jak i cytometrii przepływowej.
5. Test supresji zapalenia stawów
   1. Zmierz obrzęk obu kolan myszy przed indukcją zapalenia stawów za pomocą suwmiarki zegarowej, aby ustalić linię bazową.
   2. Postępuj zgodnie z krokami (1.3.1 - 1.3.10) dla indukcji zapalenia stawów i transferu Treg. Zmierz kolana myszy za pomocą suwmiarki zegarowej po transferze Treg.
   3. Oblicz procentowy wzrost średnicy kolana: Procentowy wzrost = (Średnica kolana w dniu 1 - Średnica kolana w dniu 0) / Średnica kolana w dniu 0.
6. Pomiar zniszczenia stawów i nacieku komórek zapalnych w kolanach za pomocą histologii (ryc. 1).
   1. W 7 dniu po indukcji zapalenia stawów należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla (CO₂), a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Usuń włosy z kolan za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia i wytnij kolana za pomocą zabiegu chirurgicznego.
   2. Usuń skórę z nóg, wykonując nacięcie w tylnej nodze nożyczkami o końcu i przeciąć skórę w poprzek uda i w dół do kostki. Delikatnie peeling skóry na nodze i stopie, aby odsłonić mięsień. Ostrożnie usuń mięsień z nogi, nie uszkadzając stawu kolanowego.
      1. Przetnij tylną nogę tuż nad stawem miednicy/biodrowym i odetnij kość piszczelową ostrymi nożyczkami preparacyjnymi.
   3. Umocuj kolana w 4% formalinie przez 48 godzin. Odwapnij kolana za pomocą 2,5 M kwasu mrówkowego; spłucz trzykrotnie ksylenem przez 3 minuty, spłucz dwa razy w 100% etanolu, spłucz dwa razy w 95% etanolu, spłucz dwukrotnie w wodzie dejonizowanej przez 2 minuty i odwapnij w 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Traktować w temperaturze poniżej wrzenia (90 °C) przez 20 minut.
   4. Usuń oba kolana, utrwal w 10% formalinie i zwapniej w Formical-4. Zanurzyć tkanki w parafinie, przeciąć na 4 μm, wybarwić hematoksyliną i eozyną (H & E) lub barwieniem Safraniną O i obserwować pod mikroskopem.

Wyniki

Rycina 1: Adoptywny transfer iPSC-Treg specyficznych dla Ag łagodzi AIA u myszy. Mysie iPSC były transdukowane za pomocą retrowirusowego konstruktu MiDR, MiDR-FoxP3 lub MiDR-TCR-FoxP3 i były hodowane wspólnie na komórkach^b OP9-DL1 / DL4 / I-A. W dniu 7 komórki transdukowane genem (3 × 10⁶ / mysz) zostały adoptywnie przeniesione do samic myszy C57BL / 6 indukowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57BL/6j	Laboratorium Jacksona	664
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS (Sieć Usługowa	Klon	Zobacz materiał SH3007.01
Polibrene	Sigma	107689
Zagłuszacz genów	Zintegrowana nauka	Numer katalogowy: 204130
mFlt-3L	Peprotech powiedział:	250-31L
mIL-7	Peprotech powiedział:	217-17
Dyrektywa w sprawie niezgodności	Sigma	A7906
Albumina komórek jajowych	Avantor (Avantor)	Numer katalogowy: 0440-01
Cfa	Firma Difco	2017014
Ogranicznik żył ogonowych	Naukowe drzewo mózgów	Stacja RTV 150-STD
Paraformaldehyd	Sigma	Zobacz materiał P6148-500G	Uwaga: Alergiczny, rakotwórczy, Toksyczny

TGL z przepisami powiedział: