Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Splenektomia i przygotowanie limfocytów T
Dzień 0:
- Wlej 10 ml pożywki z limfocytów T (TCM) do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml i umieść na lodzie w celu pobrania śledziony.
- Uśmierc odpowiednią liczbę zwierząt przez uduszenie CO2 i wtórne ścięcie: Umieść zwierzęta w klatce otrzymującej CO2 z natężeniem przepływu 10-30% objętości klatki na minutę, zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynaryjnych (nie więcej niż 5 zwierząt może być uśmierconych jednocześnie) do zakończenia oddychania i przez dwie minuty po nim. Usuń zwierzęta z komory CO2 i odetnij głowę.
nuta: Jedna śledziona 6-12-tygodniowej samicy myszy C57BL/6 da około 4,5-5 x 107 splenocytów. Tutaj zostaną pobrane 4 śledziony na około 200 x 106 komórek.
- Połóż mysz tak, aby jej prawa strona była skierowana do góry i spryskaj 70% etanolem. Za pomocą kleszczy chwyć cienki fałd skóry poniżej lewej klatki piersiowej i wytnij lekkie nacięcie nożyczkami. Oderwij skórę, ostrożnie chwyć cienki fałd otrzewnej kleszczami i wytnij mały ubytek.
- Śledziona jest małym, wydłużonym, ciemnoczerwonym narządem, który przypomina spłaszczoną fasolę; delikatnie chwyć śledzionę kleszczami i wytnij, odcinając otaczającą tkankę łączną. Umieścić wycięte śledziony w stożku zawierającym 10 ml TCM na lodzie.
- Wylać śledziony na sitko do komórek o siatku 70 μm i zdezagregować przez rozgniecenie końcem wnętrza strzykawki o pojemności 5 ml w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Maksymalnie dwie śledziony powinny być zdezagregowane na jedno siatko siatkowe.
- Użyj niewielkiej objętości TCM, aby ostrożnie umyć sitko po dezagregacji, aby zebrać pozostałe splenocyty. Zbierz wszystkie zdezagregowane śledziony w jednokomórkową zawiesinę. Doprowadzić końcową objętość do 50 ml za pomocą TCM na jedno pranie i wirować przy 300 x g przez 10 minut.
- Przygotować roztwór 1x buforu do lizy, dodając 5 ml 10x buforu do lizy do 45 ml sterylnej wody. Aby wyeliminować czerwone krwinki, ponownie zawiesić osad w 5 ml 1x buforu do lizy na śledzionę w stożkowym opakowaniu o pojemności 50 ml, dobrze mieszając, delikatnie pipetując w górę iw dół. W przypadku przekroczenia 5 śledzion należy użyć probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Umieścić probówkę stożkową lub wirówkową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut.
- Usunąć reakcję lizy z łaźni wodnej i dodać TCM w stosunku 1:1 z buforem do lizy, aby zneutralizować reakcję. Prać wirując w temperaturze 300 x g przez 10 min.
- Odessać supernatant i całkowicie zawiesić osad w TCM (2 ml/śledzionę, łącznie 8 ml na 4 śledziony) pipetując w górę i w dół.
- Policz komórki, dodając 10 μl zawiesiny komórek do 190 μl błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:20). Pomnóż liczbę uzyskaną w jednym z czterech kwadratów w siatce przez 20 x 104 x całkowita objętość (8 ml), aby uzyskać całkowitą liczbę komórek (np. 125 komórek x 20 x 104 x 8 ml = 200 x 106 splenocytów).
- Rozcieńczyć komórki do stężenia 2 x 106 komórek/ml w TCM, uzupełnione 2 μg/ml konkanawaliny A (ConA) i 50 IU / ml rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2 (rhIL-2). Tak więc, dla 200 x 106 splenocytów, dodaj 92 ml pożywki do 8 ml komórek, 200 μg ConA i 5,000 IU rhIL-2.
- Dodaj 2 ml komórek do każdej studzienki z 24-dołkowymi płytkami poddanymi kulturze tkankowej, tak aby 4 x 106 komórek znajdowało się w każdym dołku (np. 100 ml komórek będzie wymagało około 4 płytek).
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
2. Transdukcja
Dzień 1:
- Oblicz liczbę 24-dołkowych płytek niepoddanych hodowli tkankowej potrzebnych do transdukcji, mnożąc liczbę pobranych śledzion przez 2 (na 4 śledziony potrzeba 8 płytek).
- Następnie oblicz wymaganą objętość roztworu rekombinowanego ludzkiego fragmentu fibronektyny (RHFF) potrzebnego do pokrycia płytek, mnożąc (całkowita liczba dołków + 3) x 0,5 ml (8 płytek x 24 dołki = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
- Przygotować 97,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej RHFF w stężeniu 25 μg/ml, mnożąc całkowitą objętość przez 25 μg (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Dodać tę ilość RHFF do 97,5 ml PBS.
- Pokryj 24-dołkowe płytki poddane hodowli nietkankowej, dodając 0,5 ml roztworu PBS/RHFF na dołek.
- Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
Dzień 2:
- Zrzuć roztwór PBS/RHFF z płytek 24-dołkowych poddanych działaniu kultur nietkankowych.
- Dodać 1 ml/basenik 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Usuń BSA, mocno obracając płytę. Umyć, dodając 2 ml PBS.
- Zebrać supernatant wirusa, przenosząc pożywkę z każdej płytki pokrytej 293T (HEK293T)-poli-D-lizyną (PDL) ludzkiej nerki do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml i wirować przez 10 minut przy 500 x g.
- Ostrożnie przenieść supernatant wirusa do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 250 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, który mógł się utworzyć.
- Dodać świeży TCM do supernatantu wirusa tak, aby końcowa objętość była o 3 ml większa niż ilość potrzebna do studzienek pokrytych RHFF. Na przykład w przypadku 192 studzienek pokrytych RHFF należy doprowadzić objętość supernatantu wirusa do 192 + 3 ml = 195 ml.
- Wyjąć wyhodowane splenocyty z inkubatora i zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy do każdej studzienki. Przenieść do stożka o pojemności 250 ml. W przypadku korzystania z pipety wielokanałowej użycie sterylnego zbiornika przed przeniesieniem pomoże przyspieszyć ten krok. Policz zgodnie z wcześniejszym opisem i wiruj z prędkością 300 x g przez 10 minut.
- Dodać rekombinowaną ludzką interleukinę-2 (rhIL-2) do wirusowego supernatantu w stężeniu 50 j.m./ml. Na przykład dodać 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2 do 195 ml supernatantu wirusa.
- Zawiesić splenocyty w supernatancie wirusa w stężeniu 1 x 106 komórek/ml
- Dodać 1 ml/dołek zawiesiny splenocytów do 24-dołkowych płytek pokrytych RHFF.
- Wirować przez 90 minut zgodnie z następującymi ustawieniami: 770 x g, przyspieszenie = 4, hamowanie/opóźnienie = 0, 32 °C.
- Przygotować roztwór TCM o stężeniu 50 j.m./ml rhIL-2. Na przykład przygotuj roztwór 200 TCM, dodając 10 000 IU rhIL-2. Dodać 1 ml rhIL-2/TCM do każdego dołka po odwirowaniu.
- Hodowla przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
3. Hodowla i zbiór komórek T CAR
Dzień 3 i 4:
- Jeśli limfocyty T osiągną >80% konfluencji, komórki mogą zostać podzielone (zwykle dzieje się to w 3 lub 4 dniu). Aby podzielić komórki, delikatnie pipetuj w górę i w dół do każdej studzienki 2-3 razy i przenieś 1 ml z każdej studzienki do nowych dołków świeżej 24-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Następnie dodać 1 ml świeżego TCM z 50 j.m./ml IL-2 do każdej studzienki tak, aby końcowa objętość wynosiła 2 ml we wszystkich studzienkach.
- Jeśli komórki nie osiągną zbieżności >80%, wykonaj wymianę pożywki o połowę, powoli odpipetowując 1 ml pożywki od góry każdej studzienki. Unikaj przeszkadzania komórek osiadłych na dnie podczas usuwania nośnika. Dodać 1 ml świeżego TCM zawierającego 50 j.m./ml rhIL-2.
Dzień 5:
- Zawiesić limfocyty CAR T, delikatnie pipetując 3 razy w górę i w dół w każdym dołku i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Wiruj komórki w odległości 300 x g przez 10 min.
- Całkowicie zassać supernatant bez zakłócania osadu. Umyj raz PBS, policz komórki zgodnie z wcześniejszym opisem i umyj PBS po raz drugi. Typowa wydajność komórek CAR T wynosi około 1 x 106 komórek na dołek (8 płytek x 24 dołki = 192 x 106 komórek CAR T).
- Zawiesić komórki w PBS w stężeniu 5 x 107/ml do wstrzyknięcia 1 x 107 w objętości 200 μg (np. dla komórek T 192 x 106 CAR zawiesić przemyty osad w 3,84 ml PBS).
