Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB. Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Niespecyficzna ekspansja cytotoksycznych efektorowych limfocytów T
- Przygotować i napromieniować ogniwa zasilające o ciśnieniu 35 Gy. Do stymulacji komórek efektorowych 2 x 105 - 4 x 105 należy przygotować 10 x 106 komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i 1 x 106 linii komórkowych limfoblastoidalnych B (BLCL) od trzech różnych, zdrowych dawców.
- Zawieś zarówno komórki karmicielskie, jak i komórki efektorowe w 15 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS), 2 mM L-glutaminy, penicyliną (100 IU / ml) i streptomycyną (0,1 μg / ml) oraz 300 IU / ml rekombinowanej interleukiny-2 (IL-2).
- Dodać fitohemaglutyninę (PHA-L) o końcowym stężeniu 1 μg/ml, ostrożnie wymieszać i rozprowadzić 150 μl zawiesiny komórkowej na basenie w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U.
- Inkubować w temperaturze 37 °C i z 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.
- Codziennie sprawdzaj płytkę, aż w dołkach hodowlanych utworzą się duże grudki komórek (~ dzień 7).
- Przenieść komórki do kolby hodowlanej o stężeniu 1 x 106 komórek/ml w świeżej pożywce hodowlanej.
- Określ całkowitą liczbę komórek, licząc (2 razy w tygodniu) i utrzymuj je na poziomie 1 x 106 komórek/ml w świeżej pożywce hodowlanej.
nuta: Efektorowe komórki odpornościowe powinny być gotowe do podania terapeutycznego w stanie spoczynku (zwykle 3 tygodnie po początkowym bodźcu amplifikacyjnym). Czystość i reaktywność tych komórek efektorowych należy sprawdzić przed wstrzyknięciem in vivo (np. za pomocą testów in vitro).
2. Przedoperacyjne przygotowanie komórek efektorowych
- Po sprawdzeniu liczby komórek efektorowych, zebrać komórki efektorowe do probówki o pojemności 50 ml przez odwirowanie (300 x g przez 5 min).
nuta: Aby zrekompensować ewentualne straty, przygotuj nadmiar komórek (np. 50 x 106).
- Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 ml sterylnego PBS i odwirować przez 5 minut przy 300 x g w celu przeprowadzenia płukania.
- Ostrożnie i całkowicie usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml sterylnego PBS.
- Przenieść zawieszone komórki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml w celu odwirowania przy 300 x g przez 5 minut.
- Ostrożnie i całkowicie usunąć supernatant, powoli pipetując.
- Zawiesić osad komórkowy w 8 μl sterylnego PBS na mysz.
nuta: Jest to kluczowy krok.
- Zmierzyć objętość zawiesiny komórek za pomocą mikropipety. W razie potrzeby dodać sterylny PBS (20 x 106 komórek w 15 μl PBS na dawkę) i dokładnie wymieszać.
- Za pomocą mikropipety sprawdź, czy końcowa objętość na mysz wynosi od 15 do 20 μl (bezwzględnie < 20 μl).
- Utrzymuj ogniwa na lodzie do momentu wstrzyknięcia stereotaktycznego.
nuta: Więcej niż 3-godzinne punkty czasowe nie były testowane.
3. Stereotaktyczne wstrzykiwanie
- Konfiguracja sprzętu
- Zmontuj i skalibruj ramę stereotaktyczną dla małych zwierząt zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapewnić dokładność wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych (np. rozmiar strzykawki, pożądana objętość i szybkość wstrzyknięcia).
nuta: Zalecana jest powolna infuzja (tj. 2 - 3 μl/min).
- Zainstaluj materiał pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego (MSC), aby utrzymać sterylność narzędzi i chronić myszy przed infekcjami.
nuta: Umieścić "bloki izotermiczne" w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. System ten ogranicza hipotermię myszy podczas operacji. Poduszki grzewcze, które są niezbędne do opieki pozabiegowej, muszą być używane podczas ciągłego monitorowania temperatury.
- Przedoperacyjne przygotowanie zwierząt
- Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (10 mg/ml) i ksylazyny (0,1 mg/ml) w dawce 10 μl/g masy ciała myszy.
- Wykonaj test szczypania palców u nóg, aby zapewnić pełne znieczulenie i znieczulenie zwierzęcia.
nuta: Każdy ruch jest oznaką niegłębokiej analgezji i jeśli tak się stanie, potrzeba jeszcze kilku minut przed powtórzeniem operacji.
- Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, użyj nożyczek, aby usunąć sierść z miejsca operacji (między dwoma uszami, aż do nosa).
- Przedoperacyjne przygotowanie komórek
- Ostrożnie zawiesić komórki pipetą (kilka razy) przed każdym wstrzyknięciem, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.
- Ostrożnie pobrać wymaganą objętość zawiesiny komórek (15 - 20 μl) do mikrostrzykawki 22 G, aby uniknąć zasysania pęcherzyków.
nuta: Ten etap ładowania komórek do mikrostrzykawki jest ważny dla zminimalizowania różnic w wstrzykiwanych objętościach. Ponownie załaduj komórki przy każdym wstrzyknięciu między zabiegami, aby zapobiec zlepianiu się komórek i zapewnić równomierną liczbę komórek efektorowych w kohorcie.
- Następnie umieścić strzykawkę w przystosowanej pompie strzykawkowej.
- Opieka proceduralna
- Zdezynfekować pole operacyjne wacikami nasączonymi 5% roztworem jodu powidonu co najmniej 3x.
- Umieść smarującą maść okulistyczną w oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Umieść znieczuloną mysz na ramie stereotaktycznej, na ciepłym bloku izotermicznym pokrytym sterylną folią, aby utrzymać temperaturę myszy podczas operacji i ograniczyć śmiertelność.
nuta: Nos i zęby myszy powinny być odpowiednio ustawione nad listwą zębatą, aby zapewnić odpowiedni przepływ oddechowy podczas zabiegu.
- Gdy mysz znajdzie się nad listwą zębatą, mocno dokręć nauszniki pod uszami myszy, aby unieruchomić głowę.
nuta: Należy uważać, aby nie uszkodzić błony bębenkowej ani nie zakłócić oddychania.
- Wykonaj strzałkowe nacięcie skóry w linii środkowej o długości 1-2 cm sterylnymi nożyczkami wzdłuż górnej części czaszki od przodu do tyłu, aby odsłonić czaszkę.
- Zidentyfikuj przecięcie szwów strzałkowych i koronalnych (Bregma), które posłużą jako punkty orientacyjne dla lokalizacji stereotaktycznej przed wstrzyknięciem (pokazane na rysunku 1).
- Umieścić mikrostrzykawkę powyżej tego punktu.
- Przesunąć mikrostrzykawkę o 2 mm w prawo, bocznie i 0,5 mm do przodu Bregmy.
- Za pomocą mikrowiertła wykonaj mały otwór w czaszce sterylnym wiertłem o określonych współrzędnych. Uważaj, aby pozostać powierzchownym, aby uniknąć urazów mózgu.
nuta: W tym protokole komórkom odpornościowym wstrzyknięto do ustalonego guza (tydzień po wstrzyknięciu komórek nowotworowych). Skóra powinna zostać ponownie otwarta (blizna), a wstrzyknięcie powinno być wykonywane w tych samych współrzędnych, które są używane do implantacji komórek nowotworowych (jest na ogół nadal obecna do 2 tygodni po wstrzyknięciu). Wybrano współrzędne do iniekcji komórek nowotworowych i efektorowych do miąższu mózgu.
- Iniekcja komórek efektorowych układu odpornościowego
- Ostrożnie włożyć mikrostrzykawkę do wywierconego otworu i powoli przesuwając igłę do przodu o 3 mm w dół opony twardej, a następnie do tyłu o 0,5 mm do końcowej głębokości 2,5 mm przed wstrzyknięciem komórek efektorowych.
- Uruchom wstrzyknięcie komórki efektorowej z prędkością 2 - 3 μl/min i monitoruj myszy przez cały czas wstrzyknięcia.
- Po zakończeniu wstrzykiwania należy wyjąć igłę tylko na 1 mm i przytrzymać mikrostrzykawkę na miejscu przez dodatkową minutę, a następnie powoli całkowicie wyjąć mikrostrzykawkę, aby zapobiec wyciekowi z miejsca infuzji.
nuta: Po wyjęciu zwierzęcia z urządzenia stereotaktycznego należy natychmiast oczyścić sprzęt do wstrzykiwań przed nadchodzącymi eksperymentami.
- Opieka pooperacyjna i obserwacja myszy
- Wyjąć zwierzę z ramy stereotaktycznej i natychmiast nałożyć 5% roztwór powidonu z jodem na miejsce nacięcia i zamknąć skórę odpowiednim szwem chirurgicznym.
- Nałóż 2% żel lidokainy bezpośrednio na ranę i podaj 0,15 μg/g buprenorfiny we wstrzyknięciu podskórnym w celu znieczulenia pozabiegowego.
- Umieść znieczuloną mysz z powrotem w klatce nad poduszką grzewczą ustawioną na 37 °C, aby utrzymać odpowiednią temperaturę ciała myszy i uniknąć hipotermii.
nuta: Oddzielna obudowa nie jest konieczna.
- Monitoruj mysz, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia i przenieś ją do pomieszczenia mieszkalnego.
nuta: Do tej pory protokół ten jest dobrze obsługiwany, ponieważ wystąpiło niewiele nieprzewidzianych powikłań (< 5% myszy, którym wstrzyknięto).
- Codziennie monitoruj myszy i poddawaj je eutanazji, gdy zaobserwuje się jakiekolwiek pogarszające się objawy zdrowotne (np. zgarbiona postawa, ograniczona mobilność, pokłon lub znaczna utrata masy ciała [≥ 15%]).
