Genetyczna modyfikacja limfocytów CAR T przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Streszczenie

Źródło: Sterner, R. M. et al., Użycie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)

Film przedstawia proces tworzenia genetycznie modyfikowanych komórek CAR T za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Zakażenie limfocytów T lentiwirusami CRISPR i CAR powoduje modyfikacje genu docelowego i syntezę chimerycznego receptora antygenowego lub CAR, co ostatecznie prowadzi do powstania genetycznie zmodyfikowanych limfocytów CAR T.

Protokół

1. Produkcja komórek CART19

1. Izolacja, stymulacja i hodowla komórek T
   1. Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w kapturze do hodowli komórkowych, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej. Pobranie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) z pozbawionych identyfikacji normalnych stożków krwi dawcy pobranych podczas aferezy, ponieważ wiadomo, że są one żywotnym źródłem PBMC.
   2. Aby wyizolować PBMC, dodaj 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki do separacji gradientu gęstości o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć krew dawcy równą objętością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby uniknąć uwięzienia komórek.
      1. Dodaj rozcieńczoną krew dawcy ze stożka do probówki separacyjnej, uważając, aby nie naruszyć granicy faz między krwią a ośrodkiem o gradiencie gęstości. Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Zdekantować supernatant do nowego stożka o pojemności 50 ml, przemyć PBS + 2% FBS, doprowadzając do 40 ml, odwirować przy 300 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant, ponownie zawiesić w 40 ml buforu i policzyć komórki.
   3. Wyizoluj limfocyty T z PBMC za pomocą zestawu kulek magnetycznych z selekcją ujemną przy użyciu w pełni zautomatyzowanego separatora komórek zgodnie z protokołem producenta.
   4. Aby wyhodować wyizolowane limfocyty T, przygotuj pożywkę z komórek T (TCM), która składa się z 10% ludzkiej surowicy AB (v / v), 1% penicyliny, streptomycyny i glutaminy (v / v) oraz pożywki komórek krwiotwórczych bez surowicy. Wysterylizuj pożywkę, filtrując przez sterylny filtr próżniowy 0,45 μm, a następnie sterylny filtr próżniowy 0,22 μm.
   5. W dniu 0 (dzień stymulacji limfocytów T) umyj kulki CD3/CD28 przed stymulacją limfocytów T. Aby umyć, umieść wymaganą objętość koralików (użyj wystarczającej ilości koralików CD3/CD28 w stosunku 3: 1 kulki : komórki T; należy zauważyć, że stężenie kulek może być zmienne) w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić w 1 ml TCM.
   6. Miejsce w kontakcie z magnesem.
   7. Po 1 minutach odessać TCM i ponownie zawiesić w 1 ml świeżego TCM, aby umyć kulki.
   8. Powtórz tę procedurę, aby uzyskać łącznie trzy prania.
   9. Po trzecim praniu ponownie zawieś kulki w 1 ml TCM.
   10. Policz limfocyty T.
   11. Przenieś koraliki do komórek T w stosunku 3: 1 kulki: komórki.
   12. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 1 x 10⁶ komórek/ml.
   13. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny.
2. Transfekcja i transdukcja limfocytów T
   1. Prace lentiwirusowe należy wykonywać przy użyciu środków ostrożności BSL-2+, w tym kapturów do hodowli komórkowych, środków ochrony osobistej i dezynfekcji zużytych materiałów wybielaczem przed utylizacją.
   2. Zdobądź konstrukt chimerycznego receptora antygenowego-T19 (CART19) w wektorze lentiwirusowym.
      nuta: Zastosowany tutaj konstrukt CART19 został zaprojektowany, a następnie zsyntetyzowany de novo przy użyciu dostępnego na rynku dostawcy syntezy białek. Konstrukt CAR został następnie sklonowany do lentiwirusa trzeciej generacji pod kontrolą promotora EF-1α. Fragment regionu zmiennej pojedynczego łańcucha pochodzi z klonu FMC63 i rozpoznaje ludzki CD19. Konstrukt CAR19 posiada domenę kostymulacyjną 4-1BB drugiej generacji i stymulację CD3ζ (FMC63-41BBz).
   3. Przeprowadzić produkcję lentiwirusa zgodnie z wcześniejszym opisem.
      1. Krótko mówiąc, do produkcji lentiwirusa należy wykorzystać limfocyty 293T, które osiągnęły 70-90% konfluencji.
      2. Pozostawić na 30 minut inkubację w temperaturze pokojowej odczynników do transfekcji, w tym 15 μg plazmidu lentiwirusowego będącego przedmiotem zainteresowania, 18 μg wektora opakowania gag/pol/tat/rev, 7 μg wektora otoczki VSV-G, 111 μl odczynnika do wstępnego kompleksowania, 129 μl odczynnika do transfekcji i 9,0 ml pożywki do transfekcji przed dodaniem do komórek 293T. Następnie hoduj transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
      3. Zebrać, odwirować (900 x g przez 10 min), przefiltrować (filtr nylonowy 0,45 μM) i zagęścić supernatant po 24 i 48 godzinach przez ultrawirowanie przy 13 028 x g przez 18 godzin lub 112 700 x g przez 2 godziny.
      4. Zamrażać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
   4. W dniu 1 delikatnie ponownie zawiesić limfocyty T, aby rozbić rozety limfocytów T, które były stymulowane w 1 x 10⁶ / ml w dniu 0.
   5. Przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności BSL-2 + dla wszystkich prac lentiwirusowych, dodaj świeży lub mrożony zebrany wirus do stymulowanych limfocytów T przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 3,0.
3. Ekspansja limfocytów T CAR
   1. W fazie ekspansji kontynuować inkubację transdukowanych limfocytów T w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Policz limfocyty T CAR w dniach 3 i 5 i dodaj świeży, wstępnie podgrzany TCM do hodowli, aby utrzymać stężenie limfocytów T CAR na poziomie 1 x 10⁶ / ml.
   2. Usuń kulki z transdukowanych limfocytów T 6 dni po stymulacji (dzień 6) za pomocą magnesu. Zbierz, ponownie zawieś i umieść limfocyty T w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml w magnesie na 1 minutę. Następnie zebrać supernatant (zawiera limfocyty T CAR) i wyrzucić kulki.
   3. Umieść pobrane limfocyty T CAR z powrotem w hodowli o stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml, aby wznowić ekspansję.
   4. W dniu 6 ocenić ekspresję powierzchniową CAR za pomocą cytometrii przepływowej.
      nuta: Do wykrywania ekspresji powierzchniowej CAR można zastosować kilka metod, takich jak barwienie kozim przeciwciałem wtórnym anty-mysim IgG (H+L) z adsorbcją, krzyżowo lub barwienie peptydem specyficznym dla CD19, sprzężonym z fluorochromem. Tutaj weź podwielokrotność (około 100 000 limfocytów T) z hodowli i przemyj buforem przepływowym przygotowanym z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco, 2% płodowej surowicy bydlęcej i 1% azydku sodu. Wybarwić komórki przeciwciałem anty-CAR i umyć dwukrotnie. Wybarwić komórki żywym/martwym barwnikiem i przeciwciałem monoklonalnym CD3 (OKT3). Umyć komórki i ponownie zawiesić w buforze przepływowym. Pobrać na cytometr, aby określić wydajność transdukcji.
4. Kriokonserwacja limfocytów T CAR
   1. Aby zebrać i kriokonserwować limfocyty T CAR 8 dni po stymulacji (8 dzień ekspansji limfocytów T), należy pobrać komórki z hodowli.
   2. Wirować przez 5 minut przy 300 x g.
   3. Zawiesić w pożywce zamrażającej w ilości 10 milionów komórek na ml na fiolkę w pożywce zamrażającej składającej się z 10% dimetylosulfotlenku i 90% płodowej surowicy bydlęcej.
   4. Zamrozić w pojemniku zamrażającym do osiągnięcia szybkości chłodzenia -1 °C/min w zamrażarce o temperaturze -80 °C, a następnie po 48 godzinach przenieść do ciekłego azotu.
   5. Przed użyciem do eksperymentów in vitro lub in vivo należy rozmrozić limfocyty T CAR w ciepłym TCM.
   6. Umyj komórki w celu rozcieńczenia i usunięcia dimetylosulfotlenku i ponownie zawieś do stężenia 2 x 10⁶ komórek/ml w ciepłym TCM. Odpocząć przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

2. Produkcja CART19 czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF ^k/o)

1. Aby zakłócić GM-CSF, należy użyć przewodnika RNA (gRNA) ukierunkowanego na ekson 3 ludzkiego GM-CSF (CSF2) wybranego za pomocą przesiewowych gRNA, o których wcześniej doniesiono, że mają wysoką skuteczność dla genu CSF2, który koduje ludzką cytokinę GM-CSF.
   nuta: Zastosowano komercyjnie zsyntetyzowany konstrukt lentiwirusowy Cas9 trzeciej generacji klasy badawczej zawierający to gRNA (pod promotorem U6). Konstrukt zawiera gen oporności na puromycynę. Sekwencja gRNA to GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. Do produkcji lentiwirusa wykorzystaj komórki 293T, które osiągnęły 70-90% konfluencji.
3. Pozostawić 15 μg plazmidu lentiwirusowego będącego przedmiotem zainteresowania, 18 μg wektora opakowania gag/pol/tat/rev, 7 μg wektora otoczki VSV-G, 111 μl odczynnika do wstępnego kompleksowania, 129 μl odczynnika do transfekcji i 9,0 ml pożywki do transfekcji do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodaj odczynniki do transfekcji do limfocytów 293T. Hodowla w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO_{2 ).}
5. Zebrać, odwirować (900 x g przez 10 min), przefiltrować (filtr nylonowy 0,45 μM) i zagęścić supernatant po 24 i 48 godzinach przez ultrawirowanie w temperaturze 13 028 x g przez 18 godzin lub 112 700 x g przez 2 godziny i zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
6. W dniu 1 delikatnie ponownie zawieś limfocyty T, aby rozbić rozety.
7. W laboratorium zatwierdzonym przez BSL-2+ dodaj zamrożonego lub świeżo zebranego wirusa do stymulowanych limfocytów T, aby wytworzyć limfocyty T CAR. Transdukuj limfocyty T zarówno lentiwirusem CAR19, jak i GM-CSF ukierunkowanym na lentiwirusa CRISPR. Dodaj lentiwirusa CAR19 przy MOI 3. Ponieważ miareczkowanie lentiwirusa CRISPR nie było możliwe, należy użyć cząstek wirusa wygenerowanych z preparatu plazmidu 15 ug do transdukcji 10 x 10⁶ limfocytów T.
8. Zobacz pozostałe etapy stymulacji, ekspansji i kriokonserwacji komórek T, jak omówiono w kroku 1.
9. W przypadku limfocytów T edytowanych przez lentiCRISPR wykazujących oporność na puromycynę, należy potraktować komórki dichlorowodorkiem puromycyny w stężeniu 1 μg puromycyny na 1 ml w dniu 3 i dniu 5.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało monoklonalne CD3 (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	Numer katalogowy: 12-0037-42
Przeciwciało monoklonalne CD3 (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	Numer katalogowy: 17-0038-42
Wybór Taq Blue Mastermix	Naukowy Denville	C775Y51
CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 40203D
System CytoFLEX B4-R2-V2	Beckman Coulter	Zobacz materiał C10343	Cytometr przepływowy
Dimetylosulfotlenek	Millipore Sigma	D2650-100ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetyczny koncentrator cząstek)	Biosystemy stosowane	A13346
Magnes Easy 50 EasySep	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy 18002
Zestaw do izolacji ludzkich limfocytów T EasySep	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 17951	Koraliki magnetyczne do selekcji negatywnej; 17951RF zawiera końcówki i bufor
Surowica bydlęca płodu	Millipore Sigma	F8067
Mysz FITC Anti-Human CD107a	BD Pharmingen	Numer katalogowy: 555800
Medium mocujące (medium A)	Invitrogen	GAS001S100
Konstrukt gRNA GenCRISPR: Nazwa: CSF2	GenScript	Nie dotyczy	Zamówienie niestandardowe
Przewodnik CRISPR RNA 1; Gatunek: Człowiek, Wektor:
pLentiCRISPR v2; Odporność: ampicylina; Numer egzemplarza:
wysoki; Przygotowanie plazmidu: Dostawa standardowa: 4 μg (bezpłatnie
opłaty)
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	Genetyka komputerów stacjonarnych
Ludzka surowica AB; Dawcy płci męskiej; typu AB; Nam	Corning	35-060-CI
Przeciwciało monoklonalne IFN gamma (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Zestaw do nawożenia Aqua Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 405 nm	Invitrogen	L34966
Preparat limfatyczny	Technologie STEMCELL	Numer telefonu 7851
Roztwór Monenzyny, 1000X	Legenda biologiczna	420701
Mysz Anti-Human CD28 Klon CD28.2	BD Pharmingen	Numer katalogowy: 559770
Mysz Anti-Human CD49d Klon 9F10	BD Pharmingen	561892
Mysz anty-ludzka MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Pojemnik do zamrażania Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001
NALM6, klon G5	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-3273	Linia komórkowa ostrej białaczki limfoblastycznej
Woda wolna od nukleaz	Preparat Promega	Zobacz materiał P119C
Olympus Systemy filtrów próżniowych, 500 mL, Membrana PES, 0.22uM, sterylne	Genesee Scientific	25-227
Olympus Systemy filtrów próżniowych, 500 mL, Membrana PES, 0.45uM, sterylne	Genesee Scientific	25-228 Rozdział 25-228
Opti-MEM I Pożywka o obniżonej surowicy (1X), płynna	Gibco (firma Gibco)	Nr katalogowy: 31985-070
PE-CF594 Mysz anty-ludzka IL-2	BD Horyzont	562384
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X), płyn	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 10378-016
Medium przepuszczalne (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
Mini zestaw PureLink do genomowego DNA	Invitrogen	K182001
Dichlorowodorek puromycyny	MP Biomedicals, Inc.	210055210
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 28704
Szczur Anty-Człowiek GM-CSF BV421	BD Horyzont	Numer katalogowy: 562930
RoboSep-S	Technologie STEMCELL	21000	W pełni zautomatyzowany separator komórek
SepMate-50 (IVD)	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 85450
Azek sodu, 5% (w/v)	Ricca Chemiczny	7144.8-16
X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicy	Lonza	04-418Q