Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Agarwal, S., et al. Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych metodą CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Projektowanie sgRNA i zaburzenia genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T

Projektowanie CRISPR sgRNA
nuta: Kilka serwerów i programów ułatwia projektowanie specyficznych dla celu pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA). W tym protokole sgRNA zgrupowane z regularnymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) zostały zaprojektowane przy użyciu CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) i portalu projektowego gRNA z Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
1. Dla każdego genu docelowego zaprojektuj od sześciu do dziesięciu sekwencji sgRNA, aby celować we wczesne kodujące sekwencje egzonów.
  UWAGA: sgRNA powinno mieć wysoką skuteczność w zakresie celowania i niską skuteczność w stosunku do celu. Każdy algorytm uczenia maszynowego do określania skuteczności sgRNA działa nieco inaczej. Dlatego zaleca się porównanie wielu narzędzi do projektowania sgRNA i sporządzenie listy od sześciu do dziesięciu sgRNA do badań przesiewowych.
Zakłócenie genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T
1. Pozyskanie autologicznych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców-ochotników. Schematyczny oś czasu protokołu jest opisany na rysunku 1A i opisany poniżej.
2. Wyizoluj limfocyty T CD4+ i CD8+ za pomocą dostępnych na rynku zestawów selekcyjnych CD4 i CD8.
3. Połącz limfocyty T CD4 + i CD8 + w stosunku 1: 1 i inkubuj przez noc w 3x10⁶ komórek/ml w R10 uzupełnionym 5 ng / ml ludzkiej interleukiny-7 (huIL-7) i ludzkiej interleukiny -15 (huIL-15) każdy. Zaleca się dodanie IL-7 i IL-15, ponieważ wiadomo, że promują one fenotyp pamięci centralnej, a komórki T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T rozszerzone IL-7 i IL-15 mają lepszą skuteczność przeciwnowotworową w porównaniu z komórkami CAR-T ekspandowanymi interleukiną-2 (IL-2).
4. Następnego dnia należy policzyć limfocyty T i odwirować 5-10 x 10⁶ komórek przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić cały supernatant i przemyć osad komórkowy w zminimalizowanej ilości niezbędnych pożywek o zredukowanej surowicy. Zawiesić osad w 100 μl roztworu nukleofekcji zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
5. Podczas mycia komórek przygotuj kompleks rybonukleoprotein (RNP) z białkiem 9 (Cas9) i gRNA związanym z CRISPR, inkubując 10 μg nukleazy Cas9 z 5 μg sgRNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Stosunek molowy Cas9 do sgRNA wynosi 1:2,4. Zalecana jest pozorowana kontrola, która zawiera Cas9 i wzmacniacz elektroporacji, ale nie sgRNA.
  nuta: Na tym etapie można przeprowadzić multipleksową edycję genów, tworząc kompleksy RNP dla każdego celu osobno i łącząc je z komórkami w czasie nukleofekcji, jak opisano w następnym kroku. Wybór odczynników do złożenia kompleksu RNP jest kluczem do uzyskania wysokiej skuteczności nokautu (KO). Na przykład nukleazy Cas9 od różnych dostawców mają różne efekty poza celem, a chemicznie zmodyfikowane gRNA zmniejsza toksyczność dla komórek T, zwiększając w ten sposób wydajność KO.
6. Połączyć zawieszone komórki z kroku 1.2.4 z kompleksem RNP z kroku 1.2.5 i dodać 4,2 μl wzmacniacza elektroporacji 4 μM (oligonukleotyd jednoniciowego DNA [ssDNA], który nie jest homologiczny do ludzkiego genomu). Dobrze wymieszaj i przenieś do kuwet do elektroporacji. Unikaj pęcherzyków powietrza, ponieważ pogarszają one wydajność elektroporacji.
7. Elektroporacja ogniw za pomocą kodu impulsowego EH111. Po elektroporacji inkubować komórki w R10 uzupełnionym 5 ng/ml huIL-7 i huIL-15 w 5x10⁶ komórek/ml w temperaturze 30 °C przez 48 godzin na płytkach 12-dołkowych. Po 48 godzinach przystąp do aktywacji i ekspansji limfocytów T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1. Ekspansja edytowanych komórek CAR-T i podwojenie ich populacji. (A) Kalendarium edycji i produkcji CRISPR w pierwotnych ludzkich komórkach CART. (B) Podwojenie populacji w pozorowanych i edytowanych przez CRISPR komórkach CAR-T CD19 mierzone za pomocą licznika Coultera podczas ekspansji komórek CAR-T (n = 3 zdrowych dawców; KO = nokaut) (...