Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Agarwal, S., et al. Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych metodą CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Projektowanie sgRNA i zaburzenia genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T

Projektowanie CRISPR sgRNA
nuta: Kilka serwerów i programów ułatwia projektowanie specyficznych dla celu pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA). W tym protokole sgRNA zgrupowane z regularnymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) zostały zaprojektowane przy użyciu CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) i portalu projektowego gRNA z Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/publ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1. Ekspansja edytowanych komórek CAR-T i podwojenie ich populacji. (A) Kalendarium edycji i produkcji CRISPR w pierwotnych ludzkich komórkach CART. (B) Podwojenie populacji w pozorowanych i edytowanych przez CRISPR komórkach CAR-T CD19 mierzone za pomocą licznika Coultera podczas ekspansji komórek CAR-T (n = 3 zdrowych dawców; KO = nokaut) (.......