$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przechowywanie i konserwacja myszy
- Kup 6-8-tygodniowe myszy NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Trzymaj myszy w warunkach SPF z wymianą powietrza, filtrami wstępnymi i wysokowydajnymi filtrami cząstek stałych (HEPA) (0,22 μm) w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, wilgotności i ciśnieniu.
- Myszy należy przechowywać i przechowywać w autoklawowanych, indywidualnych klatkach z mikroizolatorami w systemie rack zdolnym do zarządzania wymianą powietrza z filtrami wstępnymi i filtrami HEPA (0,22 μm).
- Wykonuj wszystkie procedury i manipulacje na myszach w biologicznym dygestorii klasy II typu A2, który został wstępnie potraktowany 70% etanolem. Przed pracą w pomieszczeniu dla zwierząt weź prysznic i przebierz się w czyste fartuchy, kombinezon Tyvek, pokrowce na buty, czepek do włosów, maskę na twarz i rękawiczki. Podczas zabiegów chirurgicznych należy nosić fartuch chirurgiczny na kombinezonie Tyvek.
nuta: Przed zabiegami preferowana jest również dekontaminacja światłem ultrafioletowym (UV).
- Jeśli to możliwe, wszystkie narzędzia i odczynniki należy sterylizować w autoklawie, a następnie zdezynfekować je przed przeniesieniem do dygestoria.
- Podczas zabiegów należy wyjąć indywidualnie wentylowane klatki zwierząt ze stojaka i zdezynfekować je przed przeniesieniem do dygestoria.
- Nakarm myszy napromieniowaną dietą i podaj wodę z autoklawu. Dostarczyć napromieniony pokarm i w razie potrzeby uzupełnić go dodatkowym napromieniowanym pokarmem. Wodę w autoklawie należy wymieniać raz w tygodniu lub w razie potrzeby.
nuta: Można również użyć autoklalawowanej zakwaszonej wody. Dostarczona napromieniowana dieta miała okres przydatności do spożycia wynoszący 6 miesięcy po wyprodukowaniu.
2. Generacja humanizowanych myszy z szpikiem kostnym, wątrobą i grasicą (BLT)
UWAGA: Generacja myszy hu-BLT została opisana wcześniej.
- W dniu zabiegu należy podać myszom napromienianie całego ciała w dawce 12 cGy/g masy ciała.
- Przygotuj myszy do operacji.
- Każdej napromienianej myszy należy podać mieszaninę ketaminy w stężeniu roboczym 100 mg/kg i ksylazyny w stężeniu 12 mg/kg, które wahało się od 130 do 170 μl na mysz w przeliczeniu na masę ciała przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) w celu znieczulenia. Aby przygotować 3 ml mieszaniny ketaminy i ksylazyny, dodaj 0,27 ml ketaminy o podstawowym stężeniu 100 mg/ml i 0,03 ml ksylazyny o stężeniu 100 mg/ml do 2,7 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i dobrze wymieszaj. Przed wstrzyknięciem zdezynfekuj skórę 70% izopropanolem.
- Każdej napromienianej myszy należy podać buprenorfinę w dawce 1 mg/kg masy ciała (czas przeżycia 72 godziny, SR-LAB) we wstrzyknięciu podskórnym w celu długotrwałego leczenia bólu.
- Każdej napromieniowanej myszy należy podać 100 μl (858 μg) cefazoliny we wstrzyknięciu IP w celu przedoperacyjnej profilaktyki antybiotykowej.
- Ogol włosy myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów wokół lewej bocznej i przyśrodkowej strony myszy w późniejszym miejscu chirurgicznym używanym do odsłonięcia lewej nerki.
- Sprawdź prawidłowy poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca).
- Podaj izofluran w dawce 3-5%, jeśli w dowolnym momencie operacji potrzebne jest dodatkowe znieczulenie.
- Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. W razie potrzeby załóż kolczyk do uszu.
- Wykonaj operację wszczepienia tkanek wątroby i grasicy do lewej torebki nerkowej.
- Zdezynfekuj skórę w miejscu operacji, nakładając peeling jodowy zaczynając od środka pola operacyjnego i kierując się na zewnątrz w sposób okrężny. Powtórz ten proces z 70% izopropanolem i po raz trzeci z jodem.
- Za pomocą kleszczy najpierw załaduj jeden fragment tkanki wątroby ludzkiego płodu do trokaru. Następnie za pomocą kleszczy załaduj jeden fragment tkanki grasicy ludzkiego płodu do trokaru. Następnie za pomocą kleszczy załaduj do trokaru kolejny fragment tkanki wątroby ludzkiego płodu. Chusteczki należy przyciąć na 1-1,6 mm3 tak, aby pasowały do wewnętrznych wymiarów trokaru.
- Użyj kleszczy, aby podnieść skórę i użyj nożyczek, aby wykonać małe cięcie wzdłużnie. Przedłuż cięcie do 1,5-2 cm po lewej stronie myszy.
- Użyj kleszczy, aby podnieść warstwę mięśni i użyj nożyczek, aby wykonać małe cięcie wzdłużne. W razie potrzeby przedłuż nacięcie, aby odsłonić nerkę.
- Odsłoń nerkę, delikatnie chwytając tkankę tłuszczową otaczającą nerkę. Nie dotykać bezpośrednio miąższu nerki.
- Wykonaj nacięcie 1-2 mm na tylnym końcu torebki nerkowej za pomocą skalpela.
- Powoli wprowadzić wstępnie załadowany trokar przez nacięcie równoległe do długiej osi nerki i uwolnić tkanki między torebką nerkową a nerką.
- Ostrożnie przywróć nerkę i jelita do normalnej pozycji. Stosować wchłanialne szwy 5/0 P-3 (P-13) z igłą kołową 13 mm 3/8 w celu zamknięcia warstwy mięśniowej oraz zszywek chirurgicznych w celu zamknięcia skóry.
- Po operacji umieść mysz w czystej, autoklawowanej klatce mikroizolatora w celu rekonwalescencji.
- Aby zminimalizować straty ciepła podczas rekonwalescencji pooperacyjnej, umieść klatkę zawierającą myszy na poduszce grzewczej, która jest podłączona do pompy wodnej, która ogrzewa i cyrkuluje wodę.
- Monitoruj myszy, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek.
- W ciągu 6 godzin od zakończenia zabiegu, przez żyłę ogonową, wstrzyknąć krwiotwórcze komórki macierzyste CD34+ wyizolowane z tkanki wątroby ludzkiego płodu.
- Rozgrzej myszy za pomocą lampy grzewczej. Zdezynfekuj ogon 70% izopropanolem, a następnie wstrzyknij 1,5 do 5 × 105 komórek macierzystych/200 μl do żyły ogonowej.
- Zatrzymać krwawienie po wstrzyknięciu i umieścić myszy z powrotem w klatce z mikroizolatorem, a klatkę z mikroizolatorem do stojaka na klatki.
nuta: Myszy po operacji są zwykle trzymane razem, po pięć w klatce mikroizolatora, podczas i po rekonwalescencji. Jednak myszy są trzymane razem tylko wtedy, gdy wszystkie przeszły operację tego samego dnia.
- Sprawdzaj myszy codziennie. Uważnie monitoruj zszywki chirurgiczne i wymieniaj je w razie potrzeby. Uważnie monitoruj myszy pod kątem jakichkolwiek oznak infekcji lub dyskomfortu. Dostarczaj autoklawowaną żywność na podłogę klatki mikroizolatora przez kilka dni po operacji.
- Usuń zszywki chirurgiczne 7-10 dni po zabiegu. Podaj izofluran w stężeniu 3-5%, aby znieczulić myszy. Ostrożnie usuń zszywki, a następnie nałóż na miejsce antybiotyk i maść przeciwbólową.
- Odczekaj 9-12 tygodni na odtworzenie ludzkich komórek odpornościowych, a następnie zbierz krew obwodową z przyśrodkowej żyły odpiszczelowej od każdej z humanizowanych myszy.
- Unieruchomić przytomne myszy za pomocą odpowiedniej wielkości plastikowego pasa przytrzymującego stożek z otworem w pobliżu głowy myszy do oddychania i otworem w pobliżu tyłu myszy, aby odizolować jedną nogę. Najpierw umieść myszy w stożku przytrzymującym, a następnie delikatnie przeciągnij jedną nogę przez otwór nogi.
- Spryskaj przyśrodkową stronę izolowanej nogi 70% izopropanolem, a następnie rozprowadź antybiotyk i maść przeciwbólową w tym samym miejscu.
nuta: Maść pomaga odsłonić położenie żyły bez konieczności usuwania włosów, a także pomaga w tworzeniu kropelek krwi.
- Za pomocą igły o rozmiarze 25 G pod kątem 90° nakłuć żyłę i pobrać 50-100 μl krwi za pomocą probówki pokrytej kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) pokrytej kwasem etylenodiaminotetraoctowym. Zatamować krwawienie, uciskając miejsce sterylną gazą. Gdy krwawienie ustanie, wróć do klatki.
nuta: Maksymalne objętości krwi pobieranej to zazwyczaj 50 μl tygodniowo lub 100 μl co dwa tygodnie.
- Pobraną krew obwodową należy wykorzystać do zbadania poziomu rekonstytucji ludzkich komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej z przeciwciałami przeciwko hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. Antybiotykoterapia
- Przed antybiotykoterapią należy pobrać próbki kału przed leczeniem. Przenieś myszy do nowej autoklawizowanej klatki z mikroizolatorem.
- Codziennie przygotowuj świeży koktajl antybiotyków o szerokim spektrum działania.
- Przygotować 250 ml wody zawierającej świeżo przygotowany metronidazol (1 g/l), neomycynę (1 g/l), wankomycynę (0,5 g/l) i ampicylinę (1 g/l) dla każdej klatki mikroizolatora myszy.
nuta: Używaj autoklawizowanej lub sterylnej wody do wody pitnej uzupełnionej antybiotykiem.
- Dodaj 9,2 g mieszanki napojów słodzonych cukrem winogronowym do 250 ml wody z antybiotykiem.
nuta: Stosowanie mieszanki napojów słodzonych cukrem winogronowym maskuje gorzki smak antybiotyków i pomaga zapobiegać odwodnieniu u myszy.
- Zmieniaj antybiotyk i napój słodzony cukrem winogronowym, mieszaj wodę z dodatkiem i codziennie umieszczaj myszy w nowej klatce z autoklawą.
nuta: Myszy są koprofagiczne, a codzienna zmiana klatek zapobiega ponownemu zaszczepieniu się myszy bakteriami jelitowymi.
- Aby uzyskać maksymalne wszczepienie mikrobiomu jelitowego podobnego do ludzkiego, podawaj antybiotyki przez 14 dni. Podczas antybiotykoterapii monitoruj myszy pod kątem utraty wagi i odwodnienia. Oczekuje się, że utrata masy ciała nastąpi w ciągu pierwszych 3-4 dni, a następnie ustabilizuje się na czas trwania kuracji. Jeśli dojdzie do odwodnienia, podaj myszom sól fizjologiczną lub roztwór Ringersa we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
nuta: Inne protokoły humanizacji mikrobiomu jelitowego wymagają doustnego podawania antybiotyków. Chociaż skutecznie usuwa mysie bakterie jelitowe, odkryliśmy, że mniej inwazyjna metoda dodawania antybiotyków do wody pitnej mniej stresowała nasze humanizowane myszy i prowadziła do lepszych wyników.
4. Próbki od dawców i przeszczep kału
- Przygotuj próbki kału od ludzkiego dawcy.
- Należy użyć odpowiednio przygotowanych źródeł materiału do przeszczepu mikrobioty kałowej (FMT) do przeszczepu kału humanizowanym myszom.
- Preparaty FMT rozmrozić i podwielokrotnić je w warunkach beztlenowych w komorze beztlenowej.
- W razie potrzeby na tym etapie wymieszaj ze sobą równe części próbek kału, aby uzyskać bezstronną "ludzką" próbkę.
- Zamrażanie i rozmrażanie materiału FMT należy ograniczyć do minimum, a jeśli porcjowanie lub mieszanie próbek nie jest konieczne, należy je rozmrozić bezpośrednio przed zabiegiem.
- Przeszczep kału ludzkiego
- Po zakończeniu 14-dniowej kuracji antybiotykowej zmień wodę pitną na wodę autoklawowaną i przenieś myszy do nowej autoklawowanej klatki. Przestań codziennie zmieniać klatkę i wdrażaj harmonogram wymiany klatek raz na 1-2 tygodnie.
- Wykonaj dwa przeszczepy kału po 24 i 48 godzinach od zaprzestania antybiotyków.
- 24 godziny po kuracji antybiotykami należy rozmrozić potrzebną ilość materiału FMT i podać każdej myszy 200 μl materiału FMT przez zgłębnik doustny. Powtórz procedurę ponownie po 48 godzinach od antybiotyków.
- Rozprowadź pozostały lub resztki rozmrożonego materiału FMT na futrze humanizowanych myszy lub na ściółce klatki.