Wytwarzanie wielowalentnej szczepionki pęcherzykowej z błoną zewnętrzną

Abstract

Źródło: Feng, R., et al. Platforma szczepionki nanocząsteczkowej typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej z domeną wiążącą receptor SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film demonstruje metodę generowania szczepionek przeciwko pęcherzykom błony zewnętrznej (OMV) wyświetlającym wiele wartości. Komórki ssaków są transfekowane w celu ekspresji i wydzielania antygenów wirusowych połączonych ze znacznikiem SpyTag i znacznikiem polihistydyny. Antygeny te są następnie oczyszczane przy użyciu kolumny powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA). Oczyszczony antygen miesza się z pęcherzykami błony zewnętrznej wykazującymi ekspresję powierzchniowego białka SpyCatcher (SC). Wiele antygenów kowalencyjnie przyłącza się do SpyCatchers za pośrednictwem ich SpyTagów (ST), tworząc OMV, które wyświetlają antygen, służąc jako szczepionka wielowalentna.

Protocol

1. Budowa plazmidu

1. Wstawić sekwencję SpyCatcher kodującą DNA (ryc. 1) do opornego na ampicylinę plazmidu pThioHisA-Cytolizyna A (ClyA) (patrz tabela materiałów) między miejscami BamH I i Sal I, aby skonstruować plazmid pThioHisA ClyA-SC zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem.
2. Zremisuj zsyntetyzowany gen fuzji domeny wiążącej receptor SpyTag-SARS-CoV-2 (RBD)-znacznika polihistydyny (Histag) (Figura 1) do plazmidu pcDNA3.1 (patrz tabela materiałów) między miejscami BamH I i EcoR I, aby skonstruować plazmid pcDNA3.1 RBD-ST zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem.

2. Przygotowanie OMV-SC

1. Wykonaj transformację ClyA-SC, wykonując poniższe czynności.
   1. Dodać 5 μl roztworu plazmidu pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) do 50 μl kompetentnego szczepu BL21, delikatnie przedmuchać i ostudzić na lodzie przez 30 minut.
   2. Umieścić roztwór na 90 s w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie natychmiast umieścić zmieszany roztwór na lodzie na 3 minuty.
   3. Dodać 500 μl pożywki Luria-Bertani (LB) do zawiesiny bakteryjnej i po wymieszaniu wyhodować pożywkę w temperaturze 220 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   4. Całą przemianę należy umieścić na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml, patrz tabela materiałów) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C.
      nuta: W kolejnych eksperymentach ampicylina była utrzymywana w tym samym stężeniu w pożywce. Jeśli nie, może to spowodować utratę plazmidów w bakteriach.
2. W przypadku produkcji OMV-SC wykonaj poniższe czynności.
   1. Wyizolować pojedynczą kolonię z płytki (etap 2.1.4) do 20 ml pożywki LB (odpornej na ampicylinę) i hodować przez noc przy prędkości 220 obr./min w temperaturze 37 °C.
   2. Wprowadzić roztwór bakteryjny (z kroku 2.2.1) do 2 litrów pożywki, hodować w temperaturze 220 obr./min, 37 °C przez 5 godzin, aż do logarytmicznego etapu wzrostu (OD₆₀₀nm wynosi między 0,6 a 0,8).
   3. Gdy OD przy 600 nm roztworu bakteryjnego osiągnie 0,6-0,8, dodać beta-D-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG, patrz tabela materiałów), aby końcowe stężenie roztworu bakteryjnego wynosiło 0,5 mM, a następnie hodować przez noc przy 220 obr./min w temperaturze 25 °C.
3. Wykonaj oczyszczanie OMV-SC.
   1. Odwirować roztwór bakteryjny o sile 7 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
   2. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego 0,22 μm, a następnie zagęścić go za pomocą membrany ultrafiltracyjnej 100 kD lub kolumny z pustych włókien (patrz tabela materiałów).
   3. Przefiltrować koncentrat przez filtr membranowy 0,22 μm, następnie odwirować go przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny za pomocą ultrawirówki (patrz tabela materiałów) i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
   4. Zawiesić wytrącanie za pomocą PBS i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Roztwór może utrzymać długotrwałą stabilność w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie RBD-ST

1. Wykonaj transfekcję RBD-ST, wykonując poniższe czynności.
   1. Wybierz odpowiedni eukariotyczny system ekspresji (np. HEK293F) i hoduj komórki przez noc w temperaturze 130 obr./min w temperaturze 37 °C po wyzdrowieniu.
   2. Dodać 20 μl roztworu HEK293F komórek do automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów), zapisać liczbę komórek, dostosować stężenie do 1 x 106 komórek/ml, a następnie hodować komórki przy 130 obr./min w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
   3. Przefiltrować plazmid RBD-ST przez filtr membranowy 0,22 μm i dodać 300 μg plazmidów do pożywki do hodowli komórkowej (patrz tabela materiałów), aż ostateczna objętość wyniesie 10 ml; wstrząsać przez 10 s.
   4. Podgrzać polietylenininę (PEI, 1 mg/ml, patrz tabela materiałów) do 65 °C w łaźni wodnej, zmieszać 0,7 ml PEI z 9,3 ml pożywki do hodowli komórkowych i wstrząsać z przerwami przez 10 s,
      nuta: Nie potrząsać energicznie roztworem. W przeciwnym razie powstałe pęcherzyki mogą wpłynąć na wydajność transfekcji.
   5. Dodać roztwór plazmidu do roztworu PEI, wstrząsać mieszaniną z przerwami przez 10 s i inkubować ją w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   6. Dodać mieszaninę do 280 ml pożywki do hodowli komórkowych i hodować ją z prędkością 130 obr./min w temperaturze 37 °C przez 5 dni.
2. Wykonaj oczyszczanie RBD-ST.
   1. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 x g w temperaturze 25 °C przez 20 minut i użyć pipety do zebrania supernatantu.
   2. Napełnij kolumnę 2 ml agarozy Ni-NTA (patrz Tabela Materiałów) i przemyj ją 3x 3x PBS.
   3. Dodać imidazol (patrz tabela materiałów) do supernatantu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mM, i załadować supernatant komórki 2x.
   4. Dodać 3 objętości kolumn (CV) PBS zawierających 20 mM imidazolu do przemywania i zebrać frakcję płuczącą.
   5. Elucja gradientowa z 3 CV PBS zawierającego niskie do wysokich stężeń (np. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) imidazolu; eluować 2x dla każdego stężenia.
   6. Użyj SDS-PAGE, aby zidentyfikować RBD-ST w różnych gradientach stężeń.

4. Biokoniugacja i oczyszczanie OMV-RBD

1. Oznaczyć stężenie białka metodą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) (patrz tabela materiałów).
   1. Seryjnie rozcieńczyć wzorcowy roztwór białka albuminy surowicy bydlęcej (BSA) od 2 mg/ml do 0,0625 mg/ml, rozcieńczyć oczyszczone OMV-SC i RBD-ST 10x, a następnie wymieszać roztwory robocze BCA A i B (dostarczone w zestawie do oznaczania) w stosunku 50:1 (v/v).
   2. Dodać rozcieńczony roztwór białka (25 μl/basenik) i wymieszać z roztworem roboczym BCA (200 μl/basenik); inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   3. Zmierzyć absorbancję (OD) przy 562 nm każdej studzienki i obliczyć stężenie białka na podstawie krzywej wzorcowej.
2. Wykonaj biokoniugację OMV-SC i RBD-ST, wykonując poniższe czynności.
   1. Wymieszaj OMV-SC i RBD-ST w PBS w proporcji 40:1 (w/w).
   2. Obrócić w pionie, aby zmiksować mieszaninę przez noc z prędkością 15 obr./min w temperaturze 4 °C.
      nuta: Różne antygeny mogą reagować w różnych proporcjach. Można próbować różnych proporcji reakcji w zależności od charakterystyki antygenu.

Results

Rycina 1: Sekwencje plazmidowe wykorzystane w niniejszym badaniu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicylina sodowa	Sangon Biotechnologia	A610028
Automatyczny licznik komórek	Hrabia Gwiazda	Biotechnologicznych
Zestaw do oznaczania ilościowego białka BCA	cwbio	Zobacz materiał CW0014S
Aparatura do elektroforezy	Kawoy (Cavoy)	Zasilanie BV
Wirówka do zamrażania o dużej prędkości	Grzbiet biologiczny	Zobacz materiał H2500R
MAb myszy His-Tag	Technologia sygnalizacji komórkowej	2366 sztuk
Imidazol	Sangon Biotechnologia	A600277
Beta-D-tiogalaktopiranozyd izopropylu	Sangon Biotechnologia	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Qiagen powiedział:	Numer telefonu 70691
Pożywka do hodowli komórkowych OPM-293	Nauki biologiczne Opm	81075-001
pcDNA3.1 Plazmid RBD-ST	Genetechnika biologiczna z Wuhan
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	ZSGB-bio	ZLI-9061
Polietylen liniowy	Nauki polilogiczne	23966-1
Wstępnie wybarwiona drabinka białkowa	Thermo	Numer katalogowy: 26616
Plazmid pThioHisA ClyA-SC	Genetechnika biologiczna z Wuhan
Systemy stołowe Quixstand (kolumna z pustych włókien 100 kD)	GE Opieka zdrowotna
Bufor wczytywania SDS-PAGE (5x)	Beyotime	Zobacz materiał P0015
chlorek sodu	Sangon Biotechnologia	A100241
Przyrząd do zawieszania	Technologia życiowa	Mikser Hula
Trypton	Oxoid (Oxoid	LP0042B
Ultrawirówka	Redlica Beckman	Konsola XPN-100
Spektrofotometr ultrafioletowy	Hitachi	U-3900
Ekstrakt drożdżowy	Sangon Biotechnologia	A610961