Mysi model interpozycji aorty do badania odrzucenia naczyniowego wywołanego alloimmunologicznie

Abstract

Źródło: Enns, W., et al. Mysi model alloimmunologicznego odrzucenia naczyniowego i miażdżycy przeszczepów. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje metodę generowania modelu interpozycji aorty myszy do badania odrzucenia naczyniowego wywołanego alloimmunologicznie. Po umieszczeniu znieczulonej myszy dawcy w pozycji leżącej, aorta podnerkowa brzuszna (IAA) jest starannie izolowana od otaczających struktur. Rozgałęzione naczynia są podwiązane, a oba końce IAA są zaciśnięte, aby zapobiec przepływowi krwi przed resekcją. Następnie dawca IAA jest wszczepiany allogenicznej myszy biorcy, a przepływ krwi jest przywracany przez zespolenie w celu zbadania odrzucenia naczyniowego wywołanego alloimmunologicznie.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Użyj myszy dawców Balb/cYJ (H2^d) i myszy biorców C57Bl/6 (H2^b) do zbadania reakcji allogenicznych. Myszy są wykorzystywane do eksperymentów w wieku od 8 do 12 tygodni. Użyj myszy żeńskiej lub męskiej. Kontrole syngeniczne składają się z odcinków aorty od dawców C57Bl/6 do biorców C57Bl/6.

1. Przygotowanie dawcy i biorcy

UWAGA: Zarówno dawca, jak i biorca są znieczuleni i przygotowani przed operacją, aby zminimalizować niedokrwienie przeszczepu. W protokole stosuje się środki znieczulające do wstrzykiwań, aby zapobiec niedrożności zwierzęcia przez sprzęt potrzebny do dostarczania wziewnych środków znieczulających. Jednak w razie potrzeby odpowiednią alternatywą jest wziewny środek znieczulający. Od pierwszego wstrzyknięcia środków znieczulających cała procedura trwa około 90 minut. Czas niedokrwienny przeszczepu wynosi mniej niż 30 minut.

1. Znieczulić mysz wstrzyknięciami dootrzewnowymi ketaminy (100 mg/kg; 10 mg/ml) i ksylazyny (10 mg/kg; 1 mg/ml). Mysz zostanie uspokojona w ciągu 10 do 15 minut. Oceń głębokość znieczulenia, ściskając tłustą część poduszki stopy zwierzęcia. W razie potrzeby podawać 1/3 pierwotnej dawki koktajlu znieczulającego, aż zwierzę nie będzie wykazywać odruchu odstawienia. Uważnie monitoruj częstość oddechów po każdym podaniu koktajlu. Podczas zabiegu należy oceniać poziom znieczulenia co 15 minut, ściskając przednią ścianę brzucha parą kleszczy. Myszy powinny pozostać głęboko znieczulone przez 60 do 90 minut.
2. Nasmaruj oczy myszy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
3. Gol włosy jak najbliżej skóry w brzusznej części brzucha od połowy klatki piersiowej do łona. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naciąć skóry. Nie używaj kremu do depilacji, ponieważ może on wchłonąć się w skórę i może mieć działanie zapalne.
4. Połóż zwierzę na wznak na ręczniku nad stołem grzewczym lub podkładką.
5. Oczyścić miejsce operacji wstępnym peelingiem z 2% chloroheksydyną. Przygotuj duży obszar roboczy, aby zmaksymalizować pole operacyjne. Rozpocznij szorowanie od środka pola operacyjnego i przesuwaj się na zewnątrz liniowo lub okrężnie. Wyrzuć gazę. Powtórz tę procedurę jeszcze co najmniej 5 razy. Nałóż wacik nasączony alkoholem na ten sam obszar. Gdy alkohol wyschnie, przygotuj czyste miejsce roztworem Betadine i obłóż je sterylną gazą.

2. Kompleksowa procedura zespolenia

1. Operacja dawcy
   1. Utrzymuj technikę aseptyczną przez cały czas trwania operacji. Przed użyciem wyczyść wszystkie blaty i powierzchnie stołu chirurgicznego 0,5% przyspieszonym roztworem nadtlenku wodoru. Przed użyciem owinąć i autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne, gazy, zasłony i fartuchy. Sprawdź sterylność narzędzi za pomocą paska wskaźnikowego sterylizatora parowego umieszczonego w każdym opakowaniu. Sterylne rękawice chirurgiczne są używane i utylizowane między operacjami. W przypadku wielu operacji sterylizuj narzędzia chirurgiczne między użyciami za pomocą sterylizatora z gorącymi szklanymi kulkami.
   2. Umieść mysz dawcę na wznak na czystej, cienkiej desce z pleksiglasu owiniętej sterylną serwetą pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu 8-30X.
   3. Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia chirurgicznego, jak opisano w punkcie 1.1, należy przystąpić do zabiegu chirurgicznego.
   4. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj pojedyncze dolne podłużne nacięcie brzucha w linii środkowej, od łona do wyrostka ksylowego.
   5. Otwórz ściany brzucha, aby odsłonić jamę za pomocą małego retraktora.
   6. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką delikatnie cofnij jelita górnie do lewej strony zwierzęcia i przykryj gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Przesuń narządy rozrodcze niżej i zlokalizuj aortę podnerkową i żyłę główną dolną (IVC). Okresowo zwilżać odsłonięte tkanki roztworem soli fizjologicznej.
   7. Za pomocą kleszczy medycznych nr 5 oddziel aortę od IVC, od poziomu lewej tętnicy nerkowej do rozwidlenia. Użyj nici monofilamentowych z poliamidu 10-0, aby podwiązać małe gałęzie w pobliżu aorty.
   8. Po oddzieleniu aorty dawcy od IVC nasącz naczynie solą fizjologiczną, przykryj odsłonięty ubytek zwilżoną gazą i odłóż dawcę na bok w sterylnym miejscu. Sprawdzaj stan dawcy (czynność układu oddechowego i sercowo-naczyniowego oraz głębokość znieczulenia) co 15 minut. Rozpocznij operację na biorcy, izolując aortę, jak opisano poniżej (kroki od 2.2.1 do 2.2.7).
   9. Po oddzieleniu aorty biorcy od IVC i odłożeniu na bok, należy zwrócić dawcę pod mikroskop. Zacisk krzyżowy (proksymalny i dystalny w stosunku do interesującego segmentu) aorty dawcy, w odległości około 5 mm od siebie, z dwoma zaciskami mikronaczyniowymi 4 mm.
   10. Za pomocą mikronożyczek Vannas-Tubingen wykonaj transeks małego segmentu przeszczepu (o długości od 3 do 4 mm) aorty brzusznej.
   11. Za pomocą igły 25 G 5/8 dołączonej do strzykawki, przepłukać wyciętą aortę heparynizowanym (100 j./ml) roztworem soli fizjologicznej. Upewnij się, że końcówka igły nie styka się z naczyniem.
   12. Umieścić aortę w heparynizowanym (100 j./ml) roztworze soli fizjologicznej na lodzie i odstawić na bok. Będąc jeszcze w głębokim znieczuleniu, zwolnij zaciski mikronaczyniowe. Poddać dawcę eutanazji przez wykrwawienie.
   13. Wszczepić naczynie dawcze w ciągu 30 minut od wycięcia. Chociaż możliwe jest użycie jednego naczynia dawczego dla wielu biorców poprzez wycięcie większej długości aorty, czas niedokrwienia powinien trwać mniej niż 30 minut.
2. Operacja odbiorcy
   1. Utrzymuj technikę aseptyczną przez cały czas trwania operacji, tak jak w przypadku operacji z dawcą.
   2. Umieść mysz biorcy na wznak na cienkiej desce z pleksiglasu owiniętej sterylną serwetą pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu 8-30X.
   3. Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia należy przystąpić do zabiegu, gdy zwierzę nie wykazuje odruchu wycofania.
   4. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj pojedyncze dolne podłużne nacięcie brzucha w linii środkowej, od łona do wyrostka ksylowego.
   5. Otwórz ściany brzucha, aby odsłonić jamę za pomocą małego retraktora.
   6. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką delikatnie cofnij jelita górnie do lewej strony zwierzęcia i przykryj gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Przesuń narządy rozrodcze niżej i zlokalizuj aortę podnerkową i IVC. Okresowo zwilżać odsłonięte tkanki roztworem soli fizjologicznej.
   7. Oddziel aortę od IVC, od poziomu lewej tętnicy nerkowej do rozwidlenia. Użyj nici monofilamentowych z poliamidu 10-0, aby w razie potrzeby podwiązać małe gałęzie w pobliżu aorty.
   8. Zacisk krzyżowy (proksymalny i dystalny w stosunku do interesującego segmentu) aorty, w odległości około 5 mm od siebie, z dwoma zaciskami mikronaczyniowymi 4 mm.
   9. Za pomocą mikronożyczek Vannas-Tubingen wykonaj pojedynczą aortotomię poziomą i wyciąć mały segment (nie więcej niż 0,5 mm) aorty brzusznej, aby pomieścić przeszczep aorty dawcy.
   10. Przepłukać wyciętą aortę heparynizowanym (100 j./ml) roztworem soli fizjologicznej. Przeszczep aorty dawcy powinien mieć odpowiednią długość, aby połączyć przecięte końce aorty biorcy.
   11. Umieścić przeszczep aorty dawcy w pozycji ortotopowej i zespoleć koniec przeszczepu dawcy z końcem biorcy, dopasowując odpowiednią orientację anatomiczną przeszczepu do biorcy.
   12. Delikatnie chwyć osłonkę zewnętrzną naczynia i lekko ją przetrzyj za pomocą kleszczy medycznych nr 5. Za pomocą kleszczy wbić igłę przymocowaną do nici monofilamentowej z poliamidu 10-0 przez całą grubość ściany naczynia, aby przymocować przeszczep aorty dawcy do wyciętego naczynia biorcy. Upewnij się, że otwór naczynia nie jest zamknięty z powodu przypadkowego zszycia tylnej ścianki naczynia.
   13. W przypadku szwów ciągłych należy umieścić szwy odciągowe na godzinie 9 zarówno w górnym, jak i dolnym końcu przeszczepu. Zaczynając od górnego końca przeszczepu od godziny 3, zespolić wycięte końce za pomocą 2 szwów biegnących i przymocować szew do szwu podciągowego.
       1. Odwróć przeszczep i kontynuuj szew biegnący do grzbietowej części naczynia, spotykając się ze szwem początkowym. Zabezpiecz bez wywierania dużego nacisku na naczynie. Powtórzyć szycie dla dolnego zespolenia.
          Uwaga: Szwy przerywane rozpoczynają się w taki sam sposób jak szwy ciągłe, z tą różnicą, że naczynie jest zespolone trzema oddzielnymi szwami między szwami podtrzymującymi. Czas zespolenia wynosi zwykle 20 min.
   14. Po zakończeniu zespolenia zwolnij dystalny zacisk mikronaczyniowy, aby umożliwić przepływ krwi wstecznej i sprawdź, czy miejsca zespolenia nie przeciekają. Jeśli dojdzie do wycieku, natychmiast umieść szew, aby zamknąć uszkodzone miejsce. Jeśli w miejscach tych nie ma krwawienia, zwolnij proksymalny zacisk.
   15. Zbadaj przeszczep i sprawdź, czy nie ma niedrożności krwi w przeszczepie oraz bliższej i dalszej części naczynia biorcy. Energiczny puls w naczyniach dawcy i biorcy wskazuje, że krew przepływa swobodnie. Za pomocą kleszczy delikatnie chwyć jeden koniec szwów podciągowych i lekko pociągnij naczynie, aby sprawdzić tylną ścianę naczynia.
       nuta: Nie powinno być marszczenia ścianki naczynia na obu końcach miejsc zespolenia. Słaby przepływ krwi po zdjęciu klamer jest oznaką zakrzepicy.
   16. Wróć jelita do jamy brzusznej za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.
   17. Za pomocą uchwytu na igłę Castroviejo i kleszczyków Graefe zamknij ścianę brzucha za pomocą szwów polipropylenowych 5-0 za pomocą ciągłego szycia. Zamknij warstwę skóry tymi samymi szwami za pomocą zamknięcia podskórnego.
   18. Torbugesic (1 mg/kg) należy podać domięśniowo natychmiast po zakończeniu przeszczepu.
   19. Natychmiast podawać, w podanej kolejności, Atipamezol (1 mg/kg), ketoprofen (5 mg/kg) i podskórnie podgrzany roztwór Ringera z mleczanami.
   20. Bezpośrednio po zabiegu umieść myszy w ogrzewanej klatce pod kocem wodnym na noc (12 godzin). W okresie rekonwalescencji anestezjologicznej należy umieścić zwierzęta same w czystym, suchym i niezakłóconym miejscu. Wyłóż klatkę (w autoklawie) czystymi ręcznikami papierowymi i ustaw temperaturę koca wodnego na około 20 do 22 °C. Na podłodze klatki zapewnij suche i mokre krokiety ad libitum.
       nuta: Istotnym elementem opieki pooperacyjnej jest obserwacja zwierzęcia i odpowiednia interwencja, w razie potrzeby, podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i operacji. Niezbędna intensywność monitorowania będzie się różnić w zależności od zwierzęcia i może być większa w okresie natychmiastowej rekonwalescencji anestezjologicznej niż w późniejszym okresie rekonwalescencji pooperacyjnej.
   21. Stale monitoruj zwierzęta, które zostały poddane znieczuleniu, aż całkowicie wyzdrowieją. Zwierzę musi być w stanie utrzymać samodzielne leżenie mostka i musi wydawać się spokojne i wolne od bólu, zanim zostanie pozostawione bez opieki.
   22. Podawać buprenorfinę (0,1 mg/kg dwa razy na dobę) i ketoprofen (5 mg/kg mc. dwa razy na dobę) przez trzy dni, oba podskórnie.
   23. Monitoruj czynność układu sercowo-naczyniowego i oddechowego, temperaturę ciała oraz ból lub dyskomfort pooperacyjny podczas rekonwalescencji po znieczuleniu przez co najmniej trzy dni. Może być wymagana dodatkowa ostrożność, taka jak podawanie leków przeciwbólowych i innych leków oraz płynów pozajelitowych w celu zminimalizowania odwodnienia i utraty elektrolitów.
   24. Oceń powodzenie operacji przeszczepu, obserwując funkcję motoryczną kończyn tylnych. Całkowity sukces przeszczepu obejmuje niezakłócony przepływ krwi do tylnej kończyny i ogona, który powinien nastąpić natychmiast po wyzdrowieniu zwierzęcia i pełne wyzdrowienie bez paraliżu kończyn tylnych w drugim dniu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2B)	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Szczep# 000664
Balb/cBYJ	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Szczep# 001026
Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań USP 100 mg / ml	Ketalean (Język ketaleński)	Norma DIN 00612316
Ksylazyna do wstrzykiwań 20 mg/ml	Rompum powiedział:	Norma DIN 02169592
Ketoprofen do wstrzykiwań 100 mg/ml	Anafen	Norma DIN 01938126
Winian butorfanolu do wstrzykiwań 10 mg/ml	Torbugesic (Torbugesic)	DIN 008450000
Buprenorfina do wstrzykiwań 0,3 mg/ml	Reckitt Benckiser	B.N. 5241
Chlorowodorek atipamezolu sterylny roztwór do wstrzykiwań	Antysedan	Norma DIN 02237744
Heparyna sodowa do wstrzykiwań, USP, 1000 jednostek/ml	Dystrybucja McKesson	Norma DIN 02264315
Maść okulistyczna Tears naturale	Alcon	Norma DIN 02082519
Mikroskop stereoskopowy	Księga Leica	Zobacz materiał M80
0,9% chlorek sodu, sterylny	Korporacja Baxter
Mleczanowy roztwór Ringera, sterylny	Korporacja Baxter
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, sterylny, 10 ml	Korporacja Baxter
Podkładki nasączone alkoholem	Loris
Jod powidonu	Betadine (Betadyna)
Glukonian chloroheksydyny 4% w/v	Germi-Stat
monofilament poliamidowy	AROSurzędy	T4A10Q07
Szew, szew 10-0, 70 mikronów	firma
Szew monofilamentowy niebieski 5-0, igła P3	Etyka	Numer katalogowy 8698G
Strzykawka 1 ml	Bd	NR KAT. 309659
Strzykawka 10 ml	Bd	NR KAT. 309604
Strzykawka insulinowa 1cc TB z 28G 1/2	Bd	NR KAT. 309309
25G 7/8, igła podskórna	Bd	NR KAT. 305124
27G 1/2, igła podskórna	Bd	NR KAT. 305109
Zwijacz Colibri - 1,5 cm rozstaw 4 cm	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 17000-04
S&T CAF-4 Klips kleszczowy do nakładania, bez zamka	Narzędzia naukowe	00072-14
Kleszcze Supergrip, S&T	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 00632-11
Kleszcze medyczne nr 5	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 11253-20
Nożyczki dla niemowląt Lexer	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14078-10
Kleszcze Micro Adson ząbkowane	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11018-12
Mikronożyczki Vannas-Tubingen	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15003-08
Mikrozaciski, b-1; 3.5mm x 1mm; długość 7mm	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 00396-01
Kleszcze Graefe'a, 10cm 1x2 zęby	Narzędzia naukowe	11054-10
Castroviejo z zamkiem i szczękami wolframowymi	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 12565-14
Sterylizator gorących szklanych koralików	Inotech 250	IS-250 - Steri-250
Gazy z włókniny	Gen
Aplikatory z bawełnianą końcówką	Puritan
Trymer do brody	Wahl
Poduszka grzewcza	Sunbeam