Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie ilościowych zapasów glicerolu Bacillus Calmette-Guerin (BCG) Danish i Mycobacterium tuberculosis H37Rv
UWAGA: Wszystkie opisane protokoły zostały przeprowadzone w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 3 (BSL3).
- Rozmrozić zamrożone zapasy glicerolu szczepów BCG Danish lub H37Rv i zaszczepić 100 μl w 10 ml pożywki 7H9 uzupełnionej Tween-80 0,05% (v/v) i ADC (albumina, dekstroza, katalaza) 10% (v/v).
- Inkubować w warunkach statycznych przez tydzień w temperaturze 37 °C, aż kultura znajdzie się w fazie logarytmicznej.
- Zwiększ skalę hodowli bakteryjnej, przenosząc 10-mililitrową kulturę do 200 ml świeżej pożywki. Inkubować przez dodatkowe 20 dni w warunkach statycznych.
- Przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przez 15 minut przy 2500 x g.
- Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić osad bakteryjny w pozostałej objętości. Dodaj sterylne szklane koraliki o średnicy 3 mm do każdej probówki (10 - 15 na probówkę).
- Wiruj energicznie przez 1 minutę w celu dysocjacji grudek bakteryjnych. Zawiesić każdą osadkę w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą Tween-80 0,05% (v/v).
- Pozostaw probówki na 10 minut, aby osadzały się największe agregaty bakteryjne i szklane kulki.
- Odzyskać 9,5 ml supernatantu z każdej z 4 probówek zawierających małe grudki i pojedyncze bakterie i przenieść objętości do jednej świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (końcowa odzyskana objętość 38 ml). Wirować przez 10 minut przy 400 x g.
- Odzyskać 35 ml supernatantu (zawierającego głównie pojedyncze bakterie) w jednej świeżej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 15 ml PBS z glicerolem 50% (v/v), uzyskując końcowe stężenie glicerolu 15% (v/v).
- Delikatnie wymieszać i rozprowadzić w 1 ml porcji w odpowiednich probówkach do zamrażania. Przechowywać w temperaturze -80 °C (jedna partia zawiera około 50 porcji glicerolu).
- Aby określić ilościowo zapasy glicerolu, rozmrozić glicerol dzień po zamrożeniu i wykonać siedem dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń w oddzielnych 1,5-mililitrowych probówkach zawierających 900 μl PBS.
- Płytka 100 μl każdego rozcieńczenia w stałym podłożu agarowym 7H10 uzupełnionym ADC 10% (v/v) przygotowanym na szalkach Petriego o średnicy 55 mm.
- Ostrożnie dodaj szklane koraliki o średnicy 3 mm (ok. 10 na płytkę) i delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić objętość na płytce agarowej. Wyrzuć koraliki i uszczelnij płytkę agarową parafilmem.
- Inkubować przez 21 dni w temperaturze 37 °C i oznaczyć stężenie bakterii, licząc jednostki tworzące kolonie (CFU) w rozcieńczeniach, w których można dokładnie rozróżnić pojedyncze kolonie.
2. Szczepienie myszy
- Rozmrozić wstępnie oznaczoną ilościowo glicerolę BCG i rozcieńczyć ją w PBS, aby przygotować dwie zawiesiny. Obliczyć objętość końcową, biorąc pod uwagę, że dawka na zwierzę wynosi 100 μl w przypadku podawania podskórnego (10,7 jtk/ml w przypadku szczepienia podskórnego) i 40 μl w przypadku podawania donosowego (2,5 x 10,7 jtk w przypadku szczepienia donosowego).
- Użyj specjalistycznej stacji anestezjologicznej dla gryzoni, aby znieczulić myszy mieszaniną izofluranu i tlenu. Użyj izofluranu 5% do wywołania znieczulenia i 2% do utrzymania myszy w komorze anestezjologicznej. (Można zastosować inną akceptowaną metodę znieczulenia).
- W celu podania szczepionki podskórnej napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml igłą 26 G z 1 ml zawiesiny bakteryjnej (10-7 jtk/ml). Usuń pęcherzyki powietrza.
- Umieść znieczuloną mysz na płaskiej powierzchni w pozycji leżącej wewnątrz kaptura z przepływem laminarnym i zaszczepij podskórnie 100 μl (10-6 jtk/dawkę) szczepionki w bok grzbietu myszy. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją, aby upewnić się, że prawidłowo wraca do zdrowia po znieczuleniu.
- Zmieniać igłę strzykawki między kolejnymi podanymi dawkami myszy. Usunięto pęcherzyki powietrza, jak opisano powyżej.
- W przypadku podawania donosowego umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej wewnątrz kaptura.
- Za pomocą mikropipety pobrać 20 μl zawiesiny o stężeniu 2,5 x 107 jtk/ml. Umieścić inokulum kropla po kropli między dwoma nozdrzami, aż cała objętość zostanie zdeponowana, pozostawiając czas między kroplami, aby umożliwić myszy wdychanie objętości w.
UWAGA: myszy mogą cierpieć na niewydolność oddechową podczas tej procedury, dlatego należy je pozostawić do przyswojenia każdej kropli przed podaniem następnej, aby zapobiec jej w jak największym stopniu.
- Ponownie napełnij mikropipetę kolejnymi 20 μl i powtórz operację. Jeśli mysz zacznie budzić się ze znieczulenia po pierwszym zaszczepieniu, umieść ją w komorze anestezjologicznej przed drugą. Umieść mysz z powrotem w klatce i upewnij się, że prawidłowo dochodzi do siebie po znieczuleniu.
3. Wyzwanie donosowe myszy ze szczepem H37Rv
- Rozmrozić wstępnie oznaczoną ilościowo glicerolę H37Rv i rozcieńczyć ją w PBS, aby przygotować zawiesinę bakteryjną o stężeniu 2 500 CFU na ml. Obliczyć końcową objętość, biorąc pod uwagę, że dawka na zwierzę wynosi 40 μl.
- H37Rv jest inokulowany donosowo, jak opisano w 2,5 - 2,7. Końcowa dawka prowokacyjna na mysz wynosi 10,2 jtk/40 μl.
