Generowanie ex vivo modelu zranionej skóry owcy zakażonej patogenem bakteryjnym

Streszczenie

Źródło: Regan, H. C., et al. Nowatorski wysokoprzepustowy model ran skóry owiec ex vivo do testowania nowych antybiotyków. J. Vis. Exp. (2022).

Film pokazuje generowanie modelu skóry owczej ex vivo zakażonego Staphylococcus aureus. Wiąże się to z leczeniem biopsji skóry czoła jagniąt antybiotykami, ustaleniem łożyska rany, umieszczeniem go na przepuszczalnej membranie w wielodołkowej płytce z pożywką wolną od antybiotyków oraz ustaleniu infekcji bakteryjnej w ranie skóry.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Sterylizacja

1. Zdezynfekuj kleszcze przed pobraniem głów, pobierając czyste kleszcze i wykonując sterylizację na sucho w piecu w temperaturze 200 °C przez 1 godzinę. Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie szklane naczynia w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
2. Wszystkie opisane prace należy wykonać w szafie mikrobiologicznej klasy 2. Przygotuj wszystkie odczynniki zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Pobieranie próbek

1. W rzeźni jagnięta Swaledale były zabijane przez ogłuszenie przy użyciu elektryczności lub pistoletu z bolcem i wykrwawiane. Głowy jagnięce zbierać nie później niż 4 godziny po uboju.

3. Przygotowanie głów

1. Zdezynfekować część czoła jagnięcia, wlewając około 100 ml roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 ppm na obszar próbki. Ogol czoło głowy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i umyj obszar 200 ml roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 ppm.
2. Przetrzyj obszar etanolem i niebieską rolką i przykryj obszar próbki kremem do depilacji przez 35 minut. Delikatnie zeskrob krem do depilacji za pomocą narzędzia do skrobania i oceń obszar próbki. Jeśli pozostała znaczna ilość włosów, powtórz proces usuwania włosów.
3. Użyj kolejnych 200 ml roztworu dwutlenku chloru, aby spłukać obszar, a następnie spłucz etanolem i przetrzyj niebieską rolką.
4. Za pomocą sterylnego dziurkacza do biopsji o średnicy 8 mm wytnij 8 mm próbki skóry z przygotowanego obszaru. Usuń próbki za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela z 15 ostrzami, upewniając się, że cały tłuszcz skórny został usunięty.
5. Umieść próbki w sterylnym słoiku o pojemności 0,5 l wypełnionym sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie przenieś je do sterylnych probówek o pojemności 50 ml z 50 ml roztworu 200 ppm dwutlenku chloru, dwukrotnie odwróć i pozostaw do sterylizacji na 30 minut.
6. Wyjąć próbki z roztworu dwutlenku chloru i umyć je, umieszczając je w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 40 ml sterylnego PBS. Po umyciu każdą pojedynczą próbkę skóry należy umieścić w oddzielnym dołku na 24-dołkowej płytce.
7. Dodać 350 μl wstępnie podgrzanej pożywki, utrzymując próbkę na granicy faz powietrze-ciecz. Skład pożywki jest następujący: pożywka MK (pożywka 199 z solami Hanksa, L-glutaminianem i 1,75 mg/ml wodorowęglanu sodu) oraz F12 Hama w stosunku 1:1, z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FBS, 10% v/v), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF, 10 ng/ml), insuliny (5 μg/ml), penicyliny-streptomycyny (100 U/ml), i amfoterycyna B (2,5 μg/ml).
8. Uszczelnić 24-dołkowe płytki płytką przepuszczającą gaz, uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkanek o stężeniu 5% CO_{2 przez} okres do 24 godzin.

4. Konserwacja próbek skóry

1. Po inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną i przepłukać próbki w 500 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Do każdej próbki dodać pożywkę wolną od antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkanek o stężeniu 5% CO_{2 przez} 24 godziny w celu usunięcia pozostałości antybiotyków z próbki.
2. Jeśli po 24 godzinach w pożywce wolnej od antybiotyków wystąpi zmętnienie lub infekcja grzybicza, należy wyrzucić próbkę.

5. Przygotowanie inokulum

1. Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z 10 ml sterylnego tryptycznego bulionu sojowego. Weź świeżą płytkę agarową S. aureus i za pomocą wacika przenieś kilka kolonii do bulionu. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C przy 150 obr./min.
2. Wirować przy 4 000 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml sterylnego PBS. Powtórz dwukrotnie, aby zapewnić odpowiednie umycie komórek.
3. Ustawić inokulum na 0,6 OD₆₀₀ w sterylnym PBS. Potwierdzić ładunek inokulum, przeprowadzając ręczne liczenie żywotnych płytek.

6. Zakażenie próbek skóry

1. Przygotuj świeżą 24-dołkową płytkę z 400 μl wstępnie podgrzanej pożywki wolnej od antybiotyków i dodaj 24-dołkowe wkładki za pomocą sterylnych kleszczyków.
2. Usunąć podłoże z próbek skóry, przemyć 500 μl sterylnego PBS i usunąć płyn do płukania. Użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie przytrzymać próbkę na dnie studzienki.
3. Użyj biopsji dziurkowania 4 mm, aby wykonać centralny płat rany, przebijając się na przybliżoną głębokość 1-2 mm. Następnie za pomocą skalpela z 15 ostrzami i sterylnych ząbkowanych kleszczyków tkankowych allis należy usunąć wierzchnią warstwę płata rany. Zmienność wymiarów rany może mieć wpływ na wynik zakażenia i końcowe jednostki tworzące kolonie (CFU).
4. Gdy wszystkie próbki zostaną zranione, przenieś je do wkładek 24-dołkowych za pomocą sterylnych kleszczy. Odpipetować 15 μl inokulum bakteryjnego do łożyska rany. Następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkankowym o stężeniu 5% CO_{2 .}
5. Jeśli konieczne są dłuższe okresy inkubacji, należy usunąć pożywkę i zastąpić ją nową pożywką co 24 godziny i inkubować w tych samych warunkach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24-dołkowa płyta towarzysząca	Sls	353504
Dziurkacz do biopsji 4 mm	Williams Medical (Szpital Williamsa	Zobacz materiał D7484
Probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Fisher Naukowy	10788561
Dziurkacz do biopsji 8 mm	Williams Medical (Szpital Williamsa	Zobacz materiał D7488
Amfoterycyna B, roztwór jałowy	Sigma	Nr kat. A2942
Colour Pro Style Bezprzewodowa maszynka do strzyżenia włosów	Wahl	9639-2117X	Maszynki do strzyżenia włosów
Inkubator z podwójnym piekarnikiem	Sls	OVe1020	Piec sterylizujący
Naskórkowy czynnik wzrostu	Sls	E5036-200UG
etanol	Honeywell	458600-2,5 l
SZYNKA F12	Sigma	Nr kat. N4888
Surowica bydlęca	Labtech Międzynarodowy	CA-115/500
Kleszcze	Fisher Naukowy	15307805
Krem do depilacji	Veet powiedział:	Nie dotyczy
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Inkubator do hodowli tkankowych
Heraeus Megafuge 16R	Firma VWR	521-2242	wirówka
Włóż indywidualną 24-dołkową membranę 0,4um	VWR Polska	353095
Insulina rekombinowana ludzka	Sls	91077C-1G
Średni 199 (MK media)	Sigma	Zobacz materiał M0393
Mikropłytka, hodowla komórkowa Costar 96 studzienka	Fisher Naukowy	10687551
Wielotron	Materiały informacyjne	Nie dotyczy	Inkubator bakteryjny
Tabletki PBS	Sigma	P4417-100TAB
Penicylina-Streptomycyna	Sls	Zobacz materiał P0781
Uszczelki płytowe	Fisher Naukowy	ESI-B-100
Bezpieczny 2020	Fisher Naukowy	1284804	Komora bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy II
Ostrze skalpela numer 15	Fisher Naukowy	O305
Skalpel Swann Morton	Fisher Naukowy	11849002
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761-1KG
Ząbkowane kleszczyki tkankowe Allis	Rocialle powiedział:	RSPU500-322
Tryptyczny bulion sojowy	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Tabletki Vimoba	Laboratoria dowcipów	VMTAB75BX

powiedział: płodu TGL powiedział: powiedział: