Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Oczyszczanie i ekspansja ludzkich komórek NK
- Wyizoluj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z Buffy Coat.
- Warstwę 35 ml próbki kożucha na 15 ml Ficoll-Paque.
- Wirować przy 400 x g przez 20 minut bez hamulca i pobrać PBMC z interfejsu.
- Odzyskać PBMC przemyć trzykrotnie, dodając co najmniej równą objętość PBS, odwirowując przy 400 x g przez 5 minut i odsysając płuczkę PBC. Komórkę NK można wyizolować na tym etapie za pomocą RozetkiSep.
- Rozszerz komórki NK poprzez stymulację napromieniowanymi komórkami podajnika 10 x 106 mbIL21 w dniach 0, 7 i 14. Zastąp pożywkę świeżym RPMI zawierającym 10% FBS, 1% glutaminy, 1% penicyliny Streptomycyny i 100 IU / ml IL-2 na całą objętość pożywki co drugi dzień.
2. Projektowanie i selekcja gRNA
- Wybierz konkretne loci genomowe, które chcesz kierować na cel, korzystając z narzędzi online, np. NCBI, Ensemble.
przykład.
Opis: Transformujący czynnik wzrostu receptora beta 2 (TGFBRR2) ektodomena
Zobacz rekord: PF08917
Zobacz InterPro: IPR015013
Pozycja: 49 - 157 aa
Sekwencja celowa: ekson 4 genu TGFBR2 (ENSG00000163513)
- Aby zaprojektować gRNA, użyj narzędzi internetowych do projektowania CRISPR, takich jak http://crispr.mit.edu i "Benchling".
- Wprowadź sekwencję DNA wybraną w kroku 2.1. Wybierz ludzki (hg 19) jako genom docelowy. Przewodniki CRISPR (20 nukleotydów, po których następuje sekwencja motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM): NGG) zostaną zeskanowane z sekwencji wprowadzonej wcześniej. Pokazuje również możliwe dopasowania poza celem w całym wybranym genomie.
- Wybierz trzy najlepsze gRNA, które mają najwyższy wynik, w oparciu o ich wskaźniki on-target i off-target. Na przykład w tabeli 1 przedstawiono zaprojektowane RNA CRISPR do celowania w ekson 4 genu TGFBR2 sugerowane przez narzędzia internetowe do projektowania CRISPR.
- Uporządkuj RNA CRISPR jako syntetyczne crRNA specyficzne dla sekwencji.
- Zamów konserwatywny, transaktywujący RNA (tracrRNA), aby oddziaływał poprzez częściową homologię z crRNA.
3. Elementarzy przesiewowych do usuwania projektów
- Zaprojektuj startery obejmujące miejsca cięcia gRNA do testu mutacji T7E1.
- Użyj starterów w odległości co najmniej 100 pz od przewidywanego miejsca rozszczepienia, aby zapewnić, że po teście mutacji pojawią się małe insercja-delecja (indele) w miejscu docelowym sgRNA na 1,5% żelu agarozowym. Tabela 2 przedstawia startery, które są używane do amplifikacji ektodomeny TGFBR2.
4. Transdukcja ludzkich pierwotnych i rozszerzonych komórek NK
Uwaga: Transdukcja elementów Cas9/RNPs do NK odbywa się za pomocą elektroporacji przy użyciu systemu 4D w następujący sposób.
- Przygotowanie komórek
- W przypadku pierwotnych komórek NK należy inkubować świeżo wyizolowane komórki NK w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) w obecności 100 j.m./ml IL-2 przez 4 dni i przeprowadzić elektroporację w 5. dniu. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień, zgodnie z wcześniejszym opisem i dzień przed transdukcją.
- W przypadku ekspandowanych komórek NK należy stymulować komórki w dniu 0 napromieniowanymi ogniwami zasilającymi w stosunku 1:1 i przeprowadzić elektroporację w dniu 5 lub 6 lub 7. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień, zgodnie z wcześniejszym opisem i dzień przed transdukcją.
- W dniu elektroporacji przygotować kolbę T25 wypełnioną 8 ml świeżego RPMI zawierającego 100 j.m./ml IL-2 dla komórek poddawanych elektroporacji i kolby do wstępnej inkubacji w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
nuta: Rozmrożone komórki lub komórki, które przeszły 2. lub 3. stymulację, mogą być elektroporowane w dowolnym momencie po ich odzyskaniu, jak opisano.
- Weź 3 - 4 × 106 komórek na warunek na 26 μl mieszanki transdukcyjnej.
nuta: Bardzo wysokie stężenie ogniw NK w roztworze do elektroporacji zwiększa szybkość transdukcji.
- Umyj komórki 3 razy PBS, aby usunąć cały FBS, który zwykle zawiera aktywność RNazy. Wiruj je za każdym razem w 300 x g przez 8 minut.
nuta: Rozważ 7 warunków elektroporacji dla Cas / RNP jako pojedyncze gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) i kombinację dwóch gRNA (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) i jedną kontrolę bez Cas9 / RNP.
- Tworzą crRNA:tracerRNA/kompleks
- Zawiesić crRNA (gRNA1, gRNA2 i gRNA3) i tracerRNA w 1x roztworze TE do końcowych stężeń 200 μM. Wymieszać 2,2 μl każdego 200 μM gRNA z 200 μM tracerRNA, jak pokazano w tabeli 3.
- Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut i pozostawić do ostygnięcia na blacie stołu do temperatury pokojowej (15–25 °C). Zawieszone RNA i crRNA: tracrRNA/kompleks należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
- Tworzą kompleks RNP
Uwaga: Aby zaoszczędzić czas, należy utworzyć kompleks RNP na etapie prania 4.1.5.
- W przypadku pojedynczej reakcji dupleksowej crRNA:tracrRNA rozcieńczyć endonukleazę Cas9 do 36 μM, jak pokazano w przykładzie w tabeli 4.
- W przypadku transdukcji skojarzonej dupleksów crRNA:tracrRNA należy rozcieńczyć endonukleazę Cas9 do 36 μM, jak pokazano w przykładzie w tabeli 5.
- Dodaj endonukleazę Cas9 do crRNA: tracrRNA dupleksuje powoli, obracając końcówkę pipety, przez 30 s do 1 minuty.
- Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut. Jeśli mieszanina nie jest gotowa do użycia po inkubacji, należy przechowywać mieszaninę na lodzie do czasu użycia.
- Elektroporacja
- Dodaj cały suplement do roztworu do elektroporacji P3 i przechowuj go w temperaturze pokojowej.
- Zawiesić osad ogniwa (3 - 4 × 106 ogniw z kroku 4.1.5) w 20 μl pierwotnego roztworu do elektroporacji P3 4D. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
Uwaga: Komórek nie należy pozostawiać przez dłuższy czas w roztworze P3.
- Natychmiast dodać 5 μl kompleksu RNP (krok 4.3) do zawiesiny komórek.
- Dodaj 1 μl 100 μM wzmacniacza elektroporacji Cas9 do mieszanki Cas9/RNPs/cell.
- Przenieś mieszaninę Cas9/RNPs/ogniw do pasków elektroporacyjnych o pojemności 20 μl.
- Delikatnie postukaj w paski, aby upewnić się, że próbka zakrywa spód pasków.
- Uruchom system elektroporacji 4D i wybierz program EN-138.
Tabela 1. Trzy zaprojektowane gRNA celujące w ekson 4 ektodomeny TGFBR2 jako syntetyczny crRNA.
powiedział:
powiedział:
powiedział:
| gRNA NIE. | Sekwencja gRNA | Zamawiany jako syntetyczne crRNA |
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | /AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrGrGrGrUrUrGrGrUrUrUrGrArGrCrUrUrGrCrU/AltR2/ |
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | /AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrGrGrUrArCrGrUrGrArGrCrU/AltR2/ |
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGGCTTG 3 | /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ |
Tabela 2. Startery używane do amplifikacji genu ektodomeny TGFBR2
| TGFBR 2 ektodomena Startery FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ektodomena Podkład REV | 5 GGG CCT KNEBEL AAT CTG KOT TTA 3 |
Tabela 3. Utwórz crRNA:tracrRNA/kompleks za pomocą 200 μM RNA
| składnik | Ilość (uL) |
| 200 μM crRNA | 2.2 |
| 200 μM Znacznik RNA | 2.2 |
| Bufor IDTE | 5,6 |
| Produkt końcowy | 10 |
Tabela 4. W przypadku reakcji dupleksowej pojedynczego crRNA:tracrRNA rozcieńczyć endonukleazę Cas9 do 36 μM.
| składnik | Ilość (μL) |
| Pbs | 1 |
| crRNA:tracrRNA duplex (od kroku 4.2) | 2 (200 pmol) |
| Endonukleaza Alt-R Cas9 (zapas 61 μM) | cyfra arabska |
| Całkowita objętość | 5 ul |
Tabela 5. Do skojarzonej transdukcji crRNA:tracrRNA dupleksy rozcieńczyć endonukleazę Cas9 do 36 μM.
| składnik | Ilość (μL) |
| Pbs | 1 |
| crRNA:duplex tracrRNA (np. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:duplex tracrRNA (np. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Endonukleaza Alt-R Cas9 | cyfra arabska |
| Całkowita objętość | 5 μL |
