1. Wytwarzanie rekombinowanych żywych atenuowanych szczepionek przeciw grypie metodą genetyki odwrotnej
UWAGA: Szczegółowy protokół generowania rekombinowanych wirusów grypy metodą odwrotnej genetyki został opisany w poprzednich badaniach i wykracza poza zakres tego raportu. Krótko mówiąc, ratowanie szczepionek przeciw grypie przystosowanych do przeziębienia (CAV) odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przy poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) i obejmuje kroki opisane poniżej.
- Wygeneruj reasortant, przystosowaną do zimna szczepionkę przeciw grypie, używając jako tła przystosowanego do zimna szczepu A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), a także hemaglutyniny (HA) i zmodyfikowanej neuraminidazy (NA) szczepu A/PR/8/34 (H1N1) (Figura 1A). Modyfikacja genu NA polega na zastąpieniu przez PCR konserwatywnej sekwencji w łodydze białka (reszty od 65 do 72) krótką sekwencją cDNA kodującą peptyd SIINFEKL pochodzący z albuminy jaja kurzego (OVA) (Figura 1B). Peptyd SIINFEKL jest peptydem wysoce immunodominującym w kontekście ograniczonej odpowiedzi H-2b MHC klasy I myszy C57BL / 6.
- Płytka 106 komórek 293T na studzienkę w płytkach 6-dołkowych przy użyciu DMEM 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną (P/E).
- Przygotować mieszaninę transfekcji plazmidów: Dodać 1 μg każdego z plazmidów kodujących cDNA dla PB2, PB1, PA, NP, M, NS ze szczepu grypy A/Ann Arbor/6/60 i 1 μg plazmidów kodujących NA-SIINFEKL i HA z grypy A/PR/8/34. Dodać wstępnie podgrzaną pożywkę Opti- minimal essential medium (Opti-MEM) (15 μl na końcową objętość 100 μl/studzienkę).
- Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać 100 μl mieszanki transfekcyjnej/studzienki i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Zmień pożywkę komórkową za pomocą DMEM 0,3% BSA, 1% P/E w temperaturze 33 °C i 5% CO2 przez 5 godzin.
- Dodać 106 przepuszczalnych dla grypy komórek nerki psów Madin-Darby (MDCK) w dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającym 1 μg/ml trypsyny z trzustki bydlęcej traktowanej ketonem L-1-tozylamido-2-fenyloetylochlorometylowym (TPCK-trypsyna). Utrzymuj kokultury 293T-MDCK przez 2 - 3 dni w temperaturze 33 °C i 5% CO2 .
- Zebrać supernatanty z kokultur komórkowych MDCK-293T i oczyścić przez odwirowanie przy 260 x g przez 5 min.
