Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Procedura dla Acufection
UWAGA: Optymalna ilość DNA i obszar docelowej powierzchni skóry mogą się różnić dla różnych genów i wymagają dalszej optymalizacji. Siła nakłucia i liczba nakłuć zrogowaciałej warstwy skóry również mogą się różnić w zależności od grubości skóry. Warunki te muszą być dokładnie określone po ocenie poziomu ekspresji acufekcyjnych transkryptów genowych za pomocą qRT-PCR.
- Zważyć myszy i podać tribromoetanol (400 μg na g masy ciała) we wstrzyknięciu otrzewnowym.
UWAGA: 2,2,2-tribromoetanol jest środkiem znieczulającym do wstrzykiwań, który był powszechnie stosowany u myszy. Roztwory sporządza się przez rozpuszczenie niefarmaceutycznego 2,2,2-tribromoetanolu (2,5 g) w wodzie destylowanej (200 ml) zawierającej 2,5% 2-metylo-2-butanolu.
- Stosuj maść okulistyczną weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
nuta: Efekt znieczulenia zostanie wywołany w ciągu 1 - 2 minut. Sprawdź odruch szczypania palca u nogi, aby zapewnić wystarczającą głębokość znieczulenia przed operacją.
- Ogolić skórę grzbietu i nałożyć krem do depilacji, aby rozpuścić białka keratynowe w łodydze włosa.
nuta: Stosowanie kremu do depilacji do usuwania owłosienia ułatwi infuzję DNA do skóry.
- Użyj wacików nasączonych wodą, aby zetrzeć krem do depilacji.
nuta: Krem do depilacji jest rozpuszczalny w wodzie. Całkowite usunięcie kremu zapobiegnie przetłuszczaniu się powierzchni i zapewni lepszy efekt nakłuwania.
- Użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby zdezynfekować powierzchnię skóry.
- Zaznacz obszar docelowy (1 cm x 1 cm) na depilowanej skórze za pomocą wcześniej odmierzonego szablonu. nuta: Oznaczenie miejsca docelowego pomoże w nałożeniu wiązki igieł w górę iw dół w określonym obszarze. Jest to ważne, aby zapewnić dostarczenie tej samej ilości DNA do określonej powierzchni, aby zminimalizować różnice między eksperymentami.
- Umieść 10 μl kropli plazmidowego DNA (10 μg) na zaznaczonej skórze.
nuta: Ilość DNA do akutekcji różni się w zależności od różnych genów i rodzaju wektora ekspresji. Ilość użytego DNA powinna być dokładnie miareczkowana przed przeprowadzeniem interesującego eksperymentu. 10 μl to mała kropla płynu, która dobrze przylega do ogolonej i wydepilowanej skóry, nie zwijając się podczas nakłuwania. Uwzględnij grupę kontrolną myszy leczonych 10 μl pustego wektora DNA w celu porównania z myszami, u których zdiagnozowano badany gen.
- Przytrzymaj wiązkę igieł do akupunktury (ryc. 1B) i nakłuj zaznaczoną powierzchnię ruchem góra-dół 100 razy lub do momentu, gdy wilgoć z DNA w PBS na skórze zniknie. nuta: Może wystąpić pewne zaczerwienienie powierzchni skóry. Unikaj wykonywania głębokich nacięć, które krwawią.
Liczba ruchów nakłuwania w górę iw dół na powierzchni skóry jest funkcjonalnie określana, gdy wilgoć z DNA w PBS (10 μl) znika ze skóry. Zdecydowaliśmy się 100 razy w ciągu 30 sekund, ponieważ dało to najbardziej spójne wyniki z genów dostarczanych przez akufekcję. W razie potrzeby igły mogą być ponownie użyte do maksymalnie 6 docelowych nakłuć skóry (1 cm x 1 cm każde). Opłucz igły w 70% etanolu i PBS między ćwiczeniami. Zmień igły na nowe, gdy są lub dla innego plazmidowego DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
- Umieść zainfekowane myszy na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała do momentu przebudzenia.
- Wróć myszy do klatki, gdy odzyskają wystarczającą przytomność. nuta: Myszy z akufekcją należy przechowywać w oddzielnej klatce (mniej niż 5 zwierząt na klatkę) od klatki myszy bez akuflacji.
- Umieść butelkę z wodą na miejscu i umieść klatkę z powrotem w stojaku IVC (indywidualnie wentylowana klatka).
2. Opieka pooperacyjna
- Przez pierwsze 48 godzin po zabiegu należy ściśle monitorować myszy pod kątem dyskomfortu, w tym zmian w zachowaniu (niepokój, pobudzenie lub zaburzenia odżywiania) lub nieprawidłowego wyglądu (szorstka sierść lub zgarbiona postawa).
