Test in vitro do oceny cytotoksyczności komórek NK wobec komórek rakowych

Streszczenie

Źródło: Baik, C. H., et al. Test cytotoksyczności na płytce do oceny funkcji cytolitycznej komórek NK łożyska szczura. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje przeprowadzenie testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu określenia cytotoksyczności komórek NK (natural killer) w stosunku do docelowych komórek nowotworowych. Test określa ilościowo uwalnianie enzymu cytoplazmatycznej dehydrogenazy mleczanowej z komórek rakowych, mierząc absorbancję powstałego produktu o czerwonym zabarwieniu.

Protokół

1. Test cytotoksyczności: Protokół testu

1. Użyj 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem, poddanej hodowli, aby ustawić płytkę zgodnie z sugestią w Tabeli 1. Ta tabela przedstawia kontrole eksperymentalne i 3 zestawy kolumn eksperymentalnych NK. Można to rozszerzyć do łącznie 10 eksperymentalnych kolumn NK na 96-dołkowej płytce.
2. Odwirować płytkę testową przy 250 x g przez 4 minuty, aby upewnić się, że efektor i komórki docelowe są w kontakcie. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 5 godzin w inkubatorze z wilgotną komorą w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w celu uzyskania wystarczającego kontaktu między komórkami docelowymi i efektorowymi oraz lizy komórek docelowych przez komórki efektorowe.
   nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
3. 45 minut przed zbiorem supernatantów dodaj 10 μl 10x roztworu do lizy do studzienek o maksymalnym uwalnianiu LDH w komórce docelowej (studzienki 1E, 1F, 1G i 1H) i umieść płytkę z powrotem w wilgotnej komorze.
4. Po zakończeniu czasu inkubacji odwirować płytkę o masie 250 x g przez 4 minuty. Za pomocą pipetora wielokanałowego przenieść 50 μl porcji ze wszystkich studzienek na świeżą 96-dołkową płaskodenną płytkę testową.
   nuta: Nie dotykać dna studzienek, aby komórki nie zostały przeniesione na świeżą płytkę testową. Nie należy używać płytki poddanej działaniu kultur hodowlanych jako świeżej płytki do oznaczania.

2. Zrób odczynnik do oznaczania.

1. Po osiągnięciu temperatury pokojowej przez bufor testowy dodaj 12 ml buforu do testu do jednej butelki z mieszanką substratów. Odwróć i delikatnie wstrząśnij, aż do całkowitego rozpuszczenia. 1 butelka wystarcza na dwie płytki 96-dołkowe.
   nuta: Bufor testowy należy chronić przed światłem podczas rozmrażania. Wymieszać bezpośrednio przed użyciem.
2. Dodać 50 μl odczynnika do oznaczania do wszystkich studzienek na płytce testowej z kroku 4.6. Przykryj płytkę folią, aby chronić ją przed światłem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   nuta: Nowo przygotowany odczynnik testowy należy przechowywać w zamrażarce. Odczynnik jest dobry przez około 8 tygodni.
3. Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu zatrzymującego. Odczytać płytkę w ciągu 1 godziny po dodaniu roztworu zatrzymującego i zapisać absorbancję przy 490 nm.
   Reprezentatywne dane przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 1: Układ płytki testowej. TCS = spontaniczne uwalnianie LDH w komórce docelowej (50 μl komórek docelowych + 50 μl pożywki dla komórek docelowych); TCM = maksymalne uwalnianie LDH w komórce docelowej (50 μl komórek docelowych + 50 μl pożywki dla komórek docelowych); VCC = Volume Correction Control (50 μL pożywki dla komórek docelowych + 50 μL pożywki dla komórek NK); CMB = kontrola tła pożywki hodowlanej (50 μl pożywki dla komórek docelowych + 50 μl pożywki dla komórek NK); ECSR = Effector Cell Spontaneous Release (50 μL komórek NK + 50 μL pożywki dla komórek NK); EW = Studzienki doświadczalne (50 μL komórek docelowych + 50 μL komórek NK).

) ) ) ) ) ) ) )

1	cyfra arabska	3	4	5
Tcs	Wirtualna karta kredytowa	ECSR-1 (klasa ECSR-1	ECSR-2 (wersja europejska)	ECSR-3 (klasa ECSR-3
Tcs	Wirtualna karta kredytowa	ECSR-1 (klasa ECSR-1	ECSR-2 (wersja europejska)	ECSR-3 (klasa ECSR-3
Tcs	Wirtualna karta kredytowa	ECSR-1 (klasa ECSR-1	ECSR-2 (wersja europejska)	ECSR-3 (klasa ECSR-3
Tcs	Wirtualna karta kredytowa	ECSR-1 (klasa ECSR-1	ECSR-2 (wersja europejska)	ECSR-3 (klasa ECSR-3
Tcm	CMB (Urząd Nadzoru T	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB (Urząd Nadzoru T	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB (Urząd Nadzoru T	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB (Urząd Nadzoru T	EW-1	EW-2	EW-3

Tabela 2: Surowe dane dotyczące absorbancji płytki testowej zawierającej kontrole eksperymentalne w kolumnach 1 i 2 oraz studzienki doświadczalne do pomiaru cytotoksyczności komórek NK łożyska od szczurów NP i RUPP w stosunku do komórek docelowych YAC1.

) pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jedynki pkt. punktu pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jedn. pkt. pkt. pkt. jezdnego pkt. pkt. pkt.

1	cyfra arabska	3	4	5
		NP	RUPP (Protokół Śledczy	NP
0,615	0,484	0,473	0,463	0,471
0,586	0,484	0,458	0,474	0,469
0,61	0,486	0,464	0,459	0,469
0,605	0,55	0,524	0,526	0,543
0,576	0,504	0,519	0,502 0,528	Numer 00 528
0,565	0,512	0,515	0,513	0,531
0,563	0,581	0,526	0,508	0,519

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	CELLTREAT	Numer katalogowy: 229190	sterylne, okrągłe dno
Skrobak do komórek	rybak	8100241
Cytotox 96 Zestaw do oznaczania cytotoksyczności nieradioaktywnej	Preparat Promega	Silnik G1780
Prędkość obrotowa	Gibco (firma Gibco)	11875135	1640 Średni
Ogniwo YAC-1	Kontroler ATCC (Kontroler T	TIB-160

powiedział: