1. Synteza triakrylanu polikaprolaktonu (PCLTA)
- Suszyć 3,2 ml triolu polikaprolaktonu (PCL) o stężeniu 400 Da przez noc w temperaturze 50 °C w otwartej kolbie okrągłodennej o pojemności 200 ml, a węglan potasu (K2CO3) w szklanej fiolce w temperaturze 90 °C.
- Zmieszać triol z 6,4 ml dichlorometanu (DCM) i 4,246 gK2CO3 pod wpływem argonu.
- Zmieszać 2,72 ml chlorku akryloylu z 27,2 ml DCM i dodawać kroplami do mieszaniny reakcyjnej w kolbie przez 5 minut.
- Przykryj mieszaninę reakcyjną folią aluminiową i pozostaw w spokoju w temperaturze pokojowej przez 24 godziny pod argonem.
- Po 24 godzinach przefiltrować mieszaninę reakcyjną za pomocą bibuły filtracyjnej na lejku Buchnera pod próżnią w celu usunięcia nadmiaru odczynników.
- Wytrącić przesącz z etapu 1.5, który zawiera polimer z końcówką w eterze dietylowym w stosunku 1:3 (obj./obj.) i obrócić w temperaturze 30 °C w celu usunięcia eteru dietylowego.
2. Powstawanie polibańki
UWAGA: Wstrzyknięcie polimeru do wody dejonizowanej (DI) spowodowałoby migrację polipęcherzyków na dno fiolki, co spowodowałoby spłaszczenie dna. Użyj 10% (wag./obj.) karboksymetylocelulozy (CMC) do napełnienia szklanej fiolki, aby uniknąć spłaszczania pęcherzyków polipęcherzyków.
- Przygotować 10% (wag./obj.) roztwór CMC w wodzie DI.
- Napełnij szklaną fiolkę o pojemności 0,92 ml 0,8 ml 10% CMC za pomocą pipety transferowej o pojemności 1 ml.
- Zmieszać 1000 mg/ml 14 kDa PCL w DCM i zsyntetyzować PCLTA w stosunku 1:3 (vol/vol) do całkowitej objętości 200 μl lub przygotować 200 μl 1000 mg/ml 5 kDa diakrylanu poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGADA) w chloroformie.
- Zmieszać 2-hydroksy-4′-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon (fotoinicjator) z mieszaniną polimeru (PLGADA lub PCL/PCLTA) w proporcji 0,005:1 (obj./obj.).
- Załaduj 200 μl mieszaniny polimerów do szklanej strzykawki o pojemności 1 ml zamontowanej na pompie strzykawkowej, która jest podłączona do rurki dozującej ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 0.016 cala.
- Użyj mikrosilnika, aby kontrolować ruch rurki polimerowej do przodu i do tyłu, aby wstrzyknąć polimer do 10% CMC w szklanej fiolce, aby utworzyć polipęcherzyk.
- Utwardzać polipęcherzyki w ultrafiolecie (UV) o długości fali 254 nm przez 60 s przy 2 W/cm2.
- Błyskawiczne zamrożenie polipęcherzyków w ciekłym azocie i liofilizację przez noc w próżni 0,010 mBar i w temperaturze -85 °C.
- Oddziel polibubbles od wysuszonego CMC za pomocą kleszczy i umyj polibubbles wodą DI, aby usunąć wszelkie pozostałości CMC. Należy pamiętać, że inne polimery mogą być używane prawdopodobnie z modyfikacjami w celu zmiany kinetyki uwalniania.
3. Modulacja średnicy polipęcherzyków
- Napełnij szklaną fiolkę o pojemności 0,92 ml 10% CMC za pomocą pipety transferowej o pojemności 1 ml.
- Zmieszać PCL/PCLTA w stosunku 1:3 (vol/vol) z 1000 mg/mL 14kDa PCL i zsyntetyzować PCLTA. Wymieszać fotoinicjator z mieszaniną polimerów w stosunku 0,005:1 (vol/vol).
- Załaduj mieszaninę polimerów do szklanej strzykawki o pojemności 1 ml zamontowanej na pompie strzykawkowej, która jest podłączona do rurki dozującej ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 0.016 cala.
- Użyj mikrosilnika, aby kontrolować ruch rurki polimerowej do przodu i do tyłu, aby wstrzyknąć polimer do 10% CMC w szklanej fiolce, aby utworzyć polipęcherzyk.
- Aby uzyskać polipęcherzyki o różnych średnicach, należy zmieniać szybkość dozowania od 0,0005 do 1 μl/s.
- Zrób zdjęcia fiolki z polipęcherzykami o różnej średnicy.
- Użyj ImageJ, aby określić ilościowo średnicę polipęcherzyków i użyj rozmiaru fiolki jako skali.
4. Centrowanie ładunku w polibańce
- Modulacja lepkości PCL/PCLTA za pomocą K2CO3:
nuta: Lepkość PLGADA nie musi być modyfikowana przy użyciuK2CO3 , ponieważ lepkość 5 kDa PLAGDA przy 1000 mg/ml jest wystarczająca do centrowania ładunku.
- DodaćK2CO3 (który został wyizolowany po reakcji PCLTA) do PCLTA w różnych stężeniach, w tym 0 mg / ml, 10 mg / mL, 20 mg / mL, 40 mg / ml i 60 mg / mL.
- Zmierz lepkość dynamiczną roztworów, zmieniając szybkość ścinania od 0 do 1000 1/s za pomocą reometrii.
- Ręcznie wstrzyknąć ładunek w środek (patrz krok 4.2 w celu przygotowania mieszaniny ładunku) polipęcherzyków, które zostały utworzone przy użyciu roztworów PCL/PCLTA o różnych stężeniachK2CO3 (krok 4.1.1). Określić optymalne stężenieK2CO3 poprzez obserwację, które rozwiązanie z kroku 4.1.1 może spowodować zatrzymanie ładunku w środku.
- Centrowanie ładunku (już wykazana wykonalność w przypadku małych cząsteczek) za pomocą CMC
- Wymieszaj ładunek z 5% (wag./obj.) CMC w rotatorze przez noc, aby zwiększyć lepkość ładunku.
- Ręcznie wstrzyknąć 2 μl mieszaniny ładunku do polipęcherzyka i kontynuować utwardzanie UV przy długości fali 254 nm przez 60 s przy 2 W/cm2.
- Błyskawiczne zamrożenie pęcherzyków w ciekłym azocie przez 30 s i liofilizację przez noc w próżni 0,010 mBar i w temperaturze -85 °C.
- Oddziel polipęcherzyki od wysuszonego CMC za pomocą kleszczy i przemyj wodą DI, aby usunąć wszelkie pozostałości CMC.
- Przeciąć polipęcherzyk na pół i zobrazować połówki za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby upewnić się, że ładunek jest wyśrodkowany (patrz krok 6, aby uzyskać informacje na temat stosowanych długości fal wzbudzenia i emisji).
5. Formułowanie ładunku
UWAGA: Preparat Polybubble może zawierać różne rodzaje ładunków, w tym małe cząsteczki, białka i kwasy nukleinowe.
- Na podstawie wcześniejszych badań, w przypadku ładunku białkowego, należy stosować substancje pomocnicze, w tym glikol polietylenowy (PEG), poliwinylopirolidon (PVP) i glikopolimery, aby poprawić stabilność białka podczas formułowania polipęcherzyków.
- Uformuj polipęcherzyki na podstawie protokołu w kroku 2.
- Przygotować roztwór antygenu, dodając 17,11 g trehalozy do 625 μl antygenu HIV gp120/41.
- Ręcznie wstrzyknąć 1 μl roztworu antygenu w środek polipęcherzyka.
- Otwórz polipęcherzyki w dniach 0, 7, 14 i 21 i zarejestruj fluorescencję antygenu o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 497 nm i 520 nm.
- Określ funkcjonalność antygenu za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) i użyj 5% mleka beztłuszczowego jako buforu blokującego.
6. Wydanie ładunku
UWAGA: Mała cząsteczka lub antygen mogą być użyte jako typ ładunku
- Mała cząsteczka
- Inkubować pęcherzyki z wyśrodkowaną akryflawiną w 400 μl soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w temperaturze 37 °C, 50 °C w przypadku polipęcherzyków PLGADA i w temperaturze 37 °C, 50 °C, 70 °C w przypadku polipęcherzyków PCL/PCLTA.
nuta: Powodem, dla którego zalecamy testowanie powyżej temperatury ciała, jest: a) symulacja temperatury (50 °C), którą osiąga polipęcherzyk podczas laserowego nanoszenia złotych nanoprętów (AuNR) w PCL i PLGA; oraz b) przyspieszyć proces degradacji PCL (50 °C, 70 °C).
- W każdym punkcie czasowym zebrać supernatanty i zastąpić 400 μl świeżego PBS.
- Za pomocą czytnika płytek określić ilościowo intensywność fluorescencji w zebranych supernatantach.
nuta: Dla akryflawiny należy stosować ex/em o długości fali 416 nm/514 nm.
- antygen
- Inkubować polipęcherzyki z wyśrodkowaną surowicą albuminy bydlęcej (BSA)-488 w 400 μl PBS w temperaturze 37 °C, 50 °C dla polipęcherzyków PLGADA i w temperaturze 37 °C, 50 °C dla polipęcherzyków PCL/PCLTA.
- W każdym punkcie czasowym zebrać supernatanty i zastąpić je 400 μl świeżego PBS.
- Za pomocą czytnika płytek określić ilościowo intensywność fluorescencji w pobranych supernatantach. Użyj ex/em 497 nm/520 nm dla BSA-488.
nuta: Nie należy przeprowadzać badania uwalniania w temperaturze 70 °C dla polipęcherzyków PCL/PCLTA, aby uniknąć wystawienia antygenu na działanie ekstremalnych temperatur.