1. Hodowle komórek bakteryjnych i przygotowanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS)
UWAGA: Kroki 1.2 - 1.9 są przeprowadzane w komorze beztlenowej.
- Przygotować płytkę agarową De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) i bulion zawierający L-cysteinę i sterylizować w autoklawie.
- Wstępnie inkubować płytkę agarową MRS w komorze beztlenowejH2 utrzymywanej w temperaturze 37 °C z 20 ppm tlenu.
- Rozmrozić materiał bakteryjny Lactobacillus i zaszczepić płytkę agarową kulturą bakteryjną (ryc. 1A (i)).
- Inkubować bakterie przez 2 - 3 dni w komorze beztlenowejH2 w temperaturze 37 °C i 20 ppm tlenu, aż do uzyskania pojedynczych kolonii bakteryjnych.
- Umyj i osusz probówkę do hodowli beztętnianowej typu Hungate. Autoklawować probówkę hodowlaną w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
- Następnie inkubować probówkę w komorze beztlenowejH2 w temperaturze 37 °C i 20 ppm tlenu w celu usunięcia tlenu.
- Umieść 2-3 ml bulionu MRS w probówce. Uszczelnij rurkę korkiem z gumy butylowej i zakręć nakrętkę.
- Uzyskać pojedynczą kolonię z pętlą i umieścić ją w probówce hodowlanej o pojemności 1,5 ml z 500 μl 1x PBS. (Rysunek 1A (ii)).
- Zawiesić kolonię za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (ryc. 1A (iii)). W tym celu należy umieścić igłę strzykawki o pojemności 1 ml w środku wieczka probówki, zasysać zawieszoną kolonię, a następnie ponownie umieścić ją w pożywce bulionowej MRS. (Rysunek 1A (iv)).
- Inkubować pożywkę bulionową MRS w inkubatorze z wytrząsarką przez 2 dni (37 °C, 5% CO2, 200 obr./min).
- Zmierzyć gęstość optyczną (OD) za pomocą spektrofotometru w celu monitorowania krzywych wzrostu bakterii, aż absorbancja przy OD620 osiągnie 2,0.
- Oddzielić granulki bakteryjne od kondycjonowanej pożywki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 15 minut. Umyj zebrane granulki bakteryjne 1x PBS i ponownie zamieszaj w 4 ml RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Nie należy dodawać żadnych antybiotyków do pożywki.
- Utrzymuj granulki bakteryjne w RPMI i inkubuj w inkubatorze z wytrząsarką przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przy prędkości 100 obr./min.
- W celu przygotowania supernatantu probiotycznego usunąć osad bakteryjny przez odwirowanie w temperaturze 1000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskany supernatant należy sterylnie przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
2. Generowanie sferoid
- Przygotowanie linii komórkowych raka jelita grubego
- Hoduj linie komórkowe DLD-1, HT-29 i WiDr jako monowarstwy do 70-80% zbiegu i inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 (pożywka wzrostowa: RPMI zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny).
- W przypadku komórek hodowanych na szalce Petriego o średnicy 100 mm należy dwukrotnie przemyć płytkę 4 ml 1x PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować szalkę Petriego przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu dysocjacji komórek.
- Po inkubacji sprawdź dysocjację komórek pod mikroskopem i zneutralizuj trypsynę-EDTA za pomocą 5 ml pożywki wzrostowej.
- Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 300 x g.
- Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić ponownie z 3 ml pożywki wzrostowej.
- Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby określić żywe komórki za pomocą hemocytometru. (Rysunek 1B (i))
- Formacja sferoidalna
- W stożkowej probówce o pojemności 15 ml rozcieńczyć komórki od 2.1.5, aby uzyskać 1 - 2 x 105 komórek/ml (ryc. 1B (ii))
- Dodać końcowe stężenie 0,6% metylocelulozy do zawiesiny komórek i przenieść rozcieńczone komórki do sterylnego zbiornika.
UWAGA: Dla każdej linii komórkowej należy miareczkować i odpowiednio określać potrzebną ilość metylocelulozy.
- Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 200 μl komórek do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki o okrągłym dnie o bardzo niskim nasadce. (Rysunek 1B (iii))
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 24-36 godzin.
- Po 24 - 36 godzinach obserwuj płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że tworzy się sferoidy.
3. Leczenie komórek 3D raka jelita grubego za pomocą LCFS
- Wygeneruj sferoidy zgodnie z opisem w krokach 2 i 3.
- Przed wykonaniem zabiegu LCFS należy rozmrozić zamrożony LCFS w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 - 20 minut.
- Zaszczepić roztwór podstawowy LCFS w pożywce wzrostowej. Seryjnie rozcieńczyć do 25%, 12,5% i 6% w pożywce wzrostowej (tj. 25% LCFS = 150 μL pożywki wzrostowej + 50 μL LCFS).
- Wyjąć z inkubatora płytkę do hodowli komórkowej zawierającą sferoidy i usunąć jak najwięcej pożywki wzrostowej z każdej studzienki za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
- Dodać pożywkę wzrostową z LCFS na komórki i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 24 - 48 godzin
nuta: Objętość, która ma być użyta, zależy od rozmiaru płytki w następujący sposób: 2 ml dla 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych; 200 μl dla 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.
