Opracowanie humanizowanego modelu myszy z ludzkimi komórkami wątroby i komórkami odpornościowymi

Abstract

Źródło: Dagur, R. S. et al., Ustanowienie podwójnie humanizowanego mysiego modelu TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV.J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanego modelu myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Polega na przeszczepieniu ludzkich komórek wątroby oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych transgenicznej myszy z niedoborem odporności poprzez wstrzyknięcie dośledzionowe, co prowadzi do wszczepienia komórek wątroby i rozwoju ludzkich komórek odpornościowych.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przetwarzanie krwi pępowinowej i izolacja ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych (HSPC)

1. Wykonaj wszystkie kroki protokołu w sterylnych warunkach w komorach z przepływem laminarnym.
2. Pobrać krew pępowinową (CB) zebraną w probówkach z heparyną i zwiększyć objętość do 35 ml, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Ułożyć próbkę warstwowo na pożywce do separacji limfocytów (LSM), jak pokazano na rysunku 1, i odwirować LSM z warstwowym CB przy 400 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C bez hamulców.
   nuta: Rozcieńczyć krew ostrożnie i delikatnie, aby uniknąć mieszania na granicy faz.
3. Ostrożnie usuń górną warstwę LSM i plazmy i przenieś interfejs białego kożucha do nowej probówki za pomocą pipety transferowej.
4. Zawiesić kożuchę w 30 - 40 ml lodowatego buforu (PBS + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] + 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA]). Za pomocą pipety połączyć 20 μl zawiesiny komórek z 20 μl 0,4% błękitu trypanowego i odpipetować 10 μl mieszaniny do zewnętrznego otworu jednej z dwóch komór szkiełka liczącego i włożyć szkiełko do automatycznego licznika komórek w celu zliczenia komórek.
   nuta: Używaj lodowatego bufora na wszystkich etapach, ponieważ pomaga on utrzymać komórki przy życiu.
5. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie odessać supernatant. Następnie dodaj 300 μl lodowatego buforu.
6. Dodać 100 μl ludzkiego odczynnika blokującego receptor Fc i 100 μl monoklonalnych mysich mikrogranulek sprzężonych z przeciwciałami anty-ludzkimi CD34 dla maksymalnie 1 x^{10 8} komórek (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, dodać 10 ml lodowatego buforu w celu przepłukania komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Przeskaluj to w górę zgodnie z numerem komórki, jeśli obecnych jest więcej niż 1 x 10⁸ komórek.
7. Ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu i kontynuować etap separacji magnetycznej w celu wzbogacenia HSPC.
8. Umieść kolumnę LS o pozytywnej selekcji (patrz Tabela materiałów) w polu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie i przepuść ją przez 3 ml buforu.
9. Załaduj próbkę do kolumny LS, która może uwięzić mikrogranulki związane z ludzkim CD34+ w próbkach i pozwolić im przepływać pod wpływem grawitacji do probówki zbiorczej.
10. Przemyć kolumnę 3x buforem i zebrać elucję w tej samej probówce zbiorczej frakcji CD34^- komórek.
11. Zanurz kolumnę z 5 ml buforu, aby wymyć komórki CD34 ⁺ do nowej probówki zbiorczej. Powtórz procedurę, aby uzyskać czystość >90%.
12. Policz eluowane komórki CD34 ⁺ za pomocą barwnika błękitu trypanowego w hemocytometrze. Po zliczeniu odwirować komórki CD34⁺ o masie 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
13. Ponownie zawiesić komórki CD34⁺ w 25 μl PBS w celu wstrzyknięcia do natychmiastowego użycia podczas przeszczepu lub kriokonserwować komórki w stężeniu 1-2 milionów/ml w pożywce do zamrażania (pożywka Roswell Park Memorial Institute [pożywka RPMI 1640] + 50% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) do dalszego wykorzystania w transplantacji.
    nuta: Zawsze przeliczaj żywe komórki przed użyciem ich w przeszczepie.
14. Aby sprawdzić czystość elucji CD34⁺, należy pobrać 50 μl zawiesiny i inkubować ją z 10 μl fikoerytryny lub przeciwciała anty-ludzkiego CD34 sprzężonego z PE przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po inkubacji przeciwciał przemyć wybarwione komórki PBS, ponownie zawiesić je w 100 μl PBS, a następnie przystąpić do wykonania cytometrii przepływowej. Dodaj dodatkową rurkę z komórkami bez przeciwciał, aby zaprojektować bramkę w cytometrze przepływowym.
15. Po akwizycji przeanalizuj dane, wybierając obszar zainteresowania na wykresie rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC), a następnie bramkowanie dla pojedynczych komórek na wykresach obszaru FSC i wysokości FSC. Bramka CD34-dodatnich komórek na pojedynczych komórkach w kanale PE i wykresie obszaru SSC.

2. Przygotowanie ludzkich hepatocytów (HEP) do przeszczepu

1. Usuń kriokonserwowane hepatocyty z ciekłego azotu, szybko zanurz fiolkę w łaźni wodnej i rozmrażaj przez około 90 - 120 s.
2. Zdjąć nakrętkę fiolki i wlać rozmrożone hepatocyty do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z podgrzanym podłożem do rozmrażania.
3. Zawieś komórki, kołysząc ręcznie probówką o pojemności 50 ml przez kilka sekund.
   nuta: Nie obracaj rurki.
4. Granulować komórki w temperaturze 100 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Umyć granulowane komórki w PBS 0,1% BSA i połączyć je ze świeżymi lub rozmrożonymi HSPC (stosunek 10:1) w PBS w końcowej objętości 80 μl/mysz.

3. Postępowanie ze zwierzętami, badania przesiewowe, genotypowanie i leczenie przeszczepu ludzkich HSPC i hepatocytów

1. Postępowanie ze zwierzętami
   1. W wyniku ciężkiego niedoboru odporności myszy TK-NOG należy hodować, trzymać i obchodzić się z nimi w warunkach aseptycznych.
   2. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze na buty i maskę na twarz, aby zapobiec zakażeniu potencjalnie chorobotwórczymi mikroorganizmami.
   3. Do operacji należy używać sterylnych rękawic i narzędzi oraz obchodzić się ze zwierzętami w sposób aseptyczny przez cały czas trwania zabiegu.
2. Wybór myszy TK-NOG do eksperymentu
   1. Utrzymuj kolonię szczepu TK-NOG poprzez hodowlę samic myszy TK-NOG z samcami rodzeństwa z miotu innych niż TK-NOG i wybierz transgeniczne potomstwo przez genotypowanie.
      nuta: Przeprowadzić genotypowanie (patrz krok 3.3) w celu określenia obecności lub braku transgenu u nowonarodzonych samców i samic myszy w momencie odsadzenia.
   2. Wybieraj samców w wieku 6-8 tygodni do przeszczepu ze względu na ich wysoką wrażliwość na zmniejszenie hepatocytów eksprymujących transgen HSV-TK za pośrednictwem GCV.
   3. Zakolczykuj uszy myszy w momencie odsadzenia od piersi lub operacji, aby ułatwić identyfikację. Zanotuj wagę i stan zdrowia zwierząt.
3. Genotypowanie na obecność transgenu HSV-TK przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym
   1. Genotypowanie należy wykonać w momencie odsadzenia (zwykle w wieku 3-4 tygodni). W celu genotypowania wytnij kawałek ucha myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność i wyodrębnić genomowe DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA.
   2. Amplifikować genomowe DNA wyekstrahowane z słuchawki w mieszaninie reakcyjnej o stężeniu 20 μl w celu przeprowadzenia badania przesiewowego transgenu HSV-TK pod kontrolą ludzkiego promotora albuminy poprzez dodanie 1 μl startera do przodu 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL startera odwrotnego 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL sondy FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', i 10 μl mieszanki wzorcowej na przyrządzie do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym.
   3. Ustaw ustawienia PCR w czasie rzeczywistym w następujący sposób: 60 °C przez 30 s (etap wstępnego odczytu), 95 °C przez 10 minut (etap wstrzymania), 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę (etap PCR) i 60 °C przez 30 s (etap po odczytu).
      nuta: Cykl progu (Ct) poniżej 22 jest uważany za dodatni dla transgenu HSV-TK.
4. Leczenie z użyciem gancyklowiru i treosulfanu
   1. Za pomocą igły 27 G wstrzyknij myszom TK-NOG dootrzewnowe wstrzyknięcia GCV (6 mg / kg) 2 razy dziennie w 7 dniu i w 5 dniu w 100 μl soli fizjologicznej przed zabiegiem w celu wyczerpania transgenicznych komórek miąższowych myszy (jak pokazano w strategii eksperymentalnej na rycinie 2).
   2. W dniach 3, 2 i 1 przed operacją należy wstępnie przygotować myszy za pomocą niemieloablacyjnych dootrzewnowych dawek treosulfanu (1,5 g / kg / dzień) w 100 μl soli fizjologicznej, używając igły 27 G.
   3. Na dzień przed zabiegiem należy pobrać dwie do trzech kropli (~100 μl) krwi z żyły podżuchwowej, nakłuwając ją lancetem o średnicy 5 mm, i wyizolować surowicę przez odwirowanie (1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C) do testu aminotransferazy alaninowej (ALT) w celu oceny stopnia uszkodzenia wątroby.
5. Przygotowanie do zabiegu
   1. Użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić sierść myszy otaczającą miejsce nacięcia (po lewej stronie ściany otrzewnej) przed zabiegiem.
   2. Dostosuj przepływ tlenu do 1 l/min, a przepływ izofluranu do 3% - 5% w komorze indukcyjnej za pomocą urządzenia do znieczulania myszy. Umieszczaj jedną mysz na raz w komorze indukcyjnej w celu znieczulenia.
   3. Podłączyć jeden koniec sterylnej probówki przedłużającej (o pojemności 550 μl zawiesiny; specyfikacje znajdują się w Tabeli Materiałów) do igły 30 G, a drugi koniec do strzykawki o pojemności 1 ml.
   4. Napełnić strzykawkę zawiesiną (80 μl/mysz) połączonych HEP i HSPC (patrz punkt 2), umieścić strzykawkę w nacięciu powtarzalnej pipety dozującej i wyregulować dozownik tak, aby dozował 10 μl w każdym naciśnięciu.
   5. Po znieczuleniu myszy (zwykle po 3 - 4 minutach) przełącz przepływ izofluranu na stożek nosowy i zmniejsz szybkość przepływu izofluranu do 2% - 3%.
6. Przeszczepienie do śledziony ludzkich HSPC i hepatocytów u myszy
   1. Wszystkie etapy operacji należy wykonać w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
   2. Umieścić czystą, sterylną serwetę na powierzchni roboczej i wyszorować lewą stronę ciała każdej myszy 10 % jodowidonu, a następnie 70 % alkoholu izopropylowego, przed wykonaniem nacięcia.
   3. Wykonaj małe nacięcie (~1 - 1,5 cm długości i 5 mm głębokości) w skórze, mięśniach i otrzewnej po lewej stronie ściany otrzewnej nożyczkami typu Vanna, aby wejść do jamy otrzewnej około 5 mm poniżej dolnej krawędzi klatki piersiowej.
   4. Zlokalizuj śledzionę, pociągnij ją lekko kleszczami do obszaru operacyjnego, aby uzyskać łatwy dostęp, i włóż igłę 30 G w dolny biegun śledziony.
   5. Odblokuj tłok pipety dozującej i dozuj jednorazowo 10 μl objętości, z ograniczeniem do 60-80 μl na śledzionę. Powoli cofnąć igłę i przyciąć śledzionę klipsami do podwiązywania za pomocą aplikatora do podwiązywania.
   6. Wepchnij śledzionę z powrotem do jamy ciała za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką zwilżonych sterylnym PBS.
   7. Zamknij warstwę mięśniową ściany brzucha za pomocą wchłanialnego szwu przerywanego wzoru szwów (nie ciągłego). Osiągnij zamknięcie skóry za pomocą przerwanego wzoru szwów za pomocą szwów niewchłanialnych.

Results

Rycina 1: Schemat wzbogacania komórek CD34⁺ z krwi pępowinowej.(A) Krew pępowinową umieszcza się warstwami na pożywce separacyjnej limfocytów (LSM) i odwirowuje w celu wyizolowania płaszcza kożuchowego. (B) Kolumny LS umieszcza się na stojaku magnetycznym i przepłukuje buforem BSA, a następnie dodaje się powłokę kożuszkową. Komórki dodatnie dla CD34 są uw...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Igły 27G1/2"	BD nauki biologiczne	305109
Igły 30G1/2"	BD nauki biologiczne	305106
5 ml polistyrenowa rurka okrągłodenna 12 x 75 mm	Corning	352054
BD 1 ml strzykawka tuberkulinowa bez igły	BD nauki biologiczne	309659
Bioanalizator macierzowy BD FACS	BD Nauki biologiczne		Do kontroli czystości eluowanych komórek CD34+
Oprogramowanie macierzy BD FACS	BD Nauki biologiczne		Oprogramowanie do analizy pozyskanej komórki CD34+ na macierzy FACS
Roztwór do lizy BD FACS	BD Nauki biologiczne	349202	Aby lizować czerwone krwinki
BD LSR II	BD Nauki biologiczne		Przyrząd do pobierania próbek cytometrii przepływowej
BD Vacutainer Plastikowa probówka do pobierania krwi	BD nauki biologiczne	BD 367874	Aby pobrać krew pępowinową
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-aldrich	A9576
CD34 MicroBead Kit, ludzki	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-046-702	Do izolacji CD34+ HSPC
CD34-PE, ludzki	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-081-002	Przeciwciało stosowane do kontroli czystości eluowanych komórek CD34+
Slajdy zliczania komórek	Bio-rad	1450015
Zestaw mini tkanek ChargeSwitch gDNA	Naukowy Thermofisher	CS11204	Do ekstrakcji genomowego DNA z wkładki słuchowej
Aplikatory z bawełnianą końcówką	McKesson powiedział:	24-106-2S
DMSO (sulcotlenek dimetylu)	Sigma-aldrich	D2650-5X5ML
Zestaw przedłużający Microbore Slide Clamp(s) Stały męski Luer Lock. L: 60 cali L: 152 cm PV: 0,55 ml Sterylna ścieżka płynu	BD nauki biologiczne	Numer katalogowy: 30914	Dołączony do pipety dozującej i do załadunku z podwieszeniem HSPC i HEP
FACS Diva wersja 6	BD Nauki biologiczne		Oprogramowanie cytometru przepływowego wymagane do pobrania próbki
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco (firma Gibco)	10438026
Oprogramowanie analityczne FLOWJO v10.2	FLOWJO Sp. z o.o		Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej
Kancyklowir	APP Pharmaceuticals, Inc.	Numer katalogowy: 315110	Lek preskryptywny
Probówki Greiner MiniCollect EDTA	Greiner bio-one	450475
Pożywka do rozmrażania hepatocytów	Laboratoria badawcze Trójkąt	Zobacz materiał MCHT50
Aplikatory do klipsów podwiązujących Horizon Open	Teleskop Teleflex	537061	Do przytrzymywania klipsów podwiązujących
Hepatocyt ludzki	Laboratoria badawcze Trójkąt	KLAWIATURA1	Kriokonserwowane ludzkie hepatocyty, kwalifikowane do indukcji
Nożyczki do tęczówki, proste	Ted Pella, Inc.	Numer katalogowy: 13295
lancet	MEDIpoint (Medipunkt)	Nawłoć 5 mm
Kolumny LS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-401	Służy do wychwytywania mikrogranulek CD34+ (selekcja pozytywna)
Pożywka do separacji limfocytów (LSM)	MP Biomedycyna	Numer katalogowy: 50494	Do izolacji limfocytów z krwi obwodowej
Stojak wielofunkcyjny MACS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-303	Mieści separator Qudro MACS i kolumny LS
McPherson-Vannas Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania	Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.	Złącze RS-5605	Służy do wykonania nacięcia na skórze w celu odsłonięcia śledziony
Mikro kleszcze preparacyjne	Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.	Złącze RS-5157	Do trzymania i wyciągania śledziony z jamy otrzewnej
Mysz CD45-FITC	BD Nauki biologiczne	Numer katalogowy: 553080	Specyficzne dla myszy
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Klon	SH30256.02
Separator Qudro MACS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-090-976	mieści cztery kolumny LS
RPMI 1640 średni	Gibco (firma Gibco)	11875093
StepOne Plus PCR w czasie rzeczywistym	Biosystemy stosowane		Przyrząd używany do genotypu
Seria Stepper Powtarzalna pipeta dozująca 1 ml	DYMAX KORPORACJA	Zobacz materiał T15469	Służy do dozowania supensów HSPC i HEP w sposób kontrolowany
TaqMan Mistrzowska Mieszanka Ekspresji Genów	Naukowy Thermofisher	4369016
Automatyczny licznik komórek TC20	Bio-rad	1450102
Myszy TK-NOG			Dostarczone przez Centralny Instytut Zwierząt Doświadczalnych (CIEA, Japonia; dr Mamoru Ito i dr Hiroshi Suemizu)
Treosulfan (Treosulfan powiedział)	Medac Sp. z o.o		Prowadzone przez Dr. Joachima Baumgarta (medac GmbH)
Błękit trypanowy	Bio-rad	1450022
Mikronożyczki typu Vannas, proste, 80mm L	Ted Pella, Inc.	1346	Służy do wykonania nacięcia na skórze w celu odsłonięcia śledziony
Weck hemoklip, tradycyjne tytanowe klipsy do podwiązywania	Esutures	Numer katalogowy: 523700	Podwiązanie śledziony po wstrzyknięciu