Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przetwarzanie krwi pępowinowej i izolacja ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych (HSPC)
- Wykonaj wszystkie kroki protokołu w sterylnych warunkach w komorach z przepływem laminarnym.
- Pobrać krew pępowinową (CB) zebraną w probówkach z heparyną i zwiększyć objętość do 35 ml, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Ułożyć próbkę warstwowo na pożywce do separacji limfocytów (LSM), jak pokazano na rysunku 1, i odwirować LSM z warstwowym CB przy 400 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C bez hamulców.
nuta: Rozcieńczyć krew ostrożnie i delikatnie, aby uniknąć mieszania na granicy faz.
- Ostrożnie usuń górną warstwę LSM i plazmy i przenieś interfejs białego kożucha do nowej probówki za pomocą pipety transferowej.
- Zawiesić kożuchę w 30 - 40 ml lodowatego buforu (PBS + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] + 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA]). Za pomocą pipety połączyć 20 μl zawiesiny komórek z 20 μl 0,4% błękitu trypanowego i odpipetować 10 μl mieszaniny do zewnętrznego otworu jednej z dwóch komór szkiełka liczącego i włożyć szkiełko do automatycznego licznika komórek w celu zliczenia komórek.
nuta: Używaj lodowatego bufora na wszystkich etapach, ponieważ pomaga on utrzymać komórki przy życiu.
- Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie odessać supernatant. Następnie dodaj 300 μl lodowatego buforu.
- Dodać 100 μl ludzkiego odczynnika blokującego receptor Fc i 100 μl monoklonalnych mysich mikrogranulek sprzężonych z przeciwciałami anty-ludzkimi CD34 dla maksymalnie 1 x10 8 komórek (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, dodać 10 ml lodowatego buforu w celu przepłukania komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Przeskaluj to w górę zgodnie z numerem komórki, jeśli obecnych jest więcej niż 1 x 108 komórek.
- Ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu i kontynuować etap separacji magnetycznej w celu wzbogacenia HSPC.
- Umieść kolumnę LS o pozytywnej selekcji (patrz Tabela materiałów) w polu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie i przepuść ją przez 3 ml buforu.
- Załaduj próbkę do kolumny LS, która może uwięzić mikrogranulki związane z ludzkim CD34+ w próbkach i pozwolić im przepływać pod wpływem grawitacji do probówki zbiorczej.
- Przemyć kolumnę 3x buforem i zebrać elucję w tej samej probówce zbiorczej frakcji CD34- komórek.
- Zanurz kolumnę z 5 ml buforu, aby wymyć komórki CD34 + do nowej probówki zbiorczej. Powtórz procedurę, aby uzyskać czystość >90%.
- Policz eluowane komórki CD34 + za pomocą barwnika błękitu trypanowego w hemocytometrze. Po zliczeniu odwirować komórki CD34+ o masie 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki CD34+ w 25 μl PBS w celu wstrzyknięcia do natychmiastowego użycia podczas przeszczepu lub kriokonserwować komórki w stężeniu 1-2 milionów/ml w pożywce do zamrażania (pożywka Roswell Park Memorial Institute [pożywka RPMI 1640] + 50% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) do dalszego wykorzystania w transplantacji.
nuta: Zawsze przeliczaj żywe komórki przed użyciem ich w przeszczepie.
- Aby sprawdzić czystość elucji CD34+, należy pobrać 50 μl zawiesiny i inkubować ją z 10 μl fikoerytryny lub przeciwciała anty-ludzkiego CD34 sprzężonego z PE przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po inkubacji przeciwciał przemyć wybarwione komórki PBS, ponownie zawiesić je w 100 μl PBS, a następnie przystąpić do wykonania cytometrii przepływowej. Dodaj dodatkową rurkę z komórkami bez przeciwciał, aby zaprojektować bramkę w cytometrze przepływowym.
- Po akwizycji przeanalizuj dane, wybierając obszar zainteresowania na wykresie rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC), a następnie bramkowanie dla pojedynczych komórek na wykresach obszaru FSC i wysokości FSC. Bramka CD34-dodatnich komórek na pojedynczych komórkach w kanale PE i wykresie obszaru SSC.
2. Przygotowanie ludzkich hepatocytów (HEP) do przeszczepu
- Usuń kriokonserwowane hepatocyty z ciekłego azotu, szybko zanurz fiolkę w łaźni wodnej i rozmrażaj przez około 90 - 120 s.
- Zdjąć nakrętkę fiolki i wlać rozmrożone hepatocyty do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z podgrzanym podłożem do rozmrażania.
- Zawieś komórki, kołysząc ręcznie probówką o pojemności 50 ml przez kilka sekund.
nuta: Nie obracaj rurki.
- Granulować komórki w temperaturze 100 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Umyć granulowane komórki w PBS 0,1% BSA i połączyć je ze świeżymi lub rozmrożonymi HSPC (stosunek 10:1) w PBS w końcowej objętości 80 μl/mysz.
3. Postępowanie ze zwierzętami, badania przesiewowe, genotypowanie i leczenie przeszczepu ludzkich HSPC i hepatocytów
- Postępowanie ze zwierzętami
- W wyniku ciężkiego niedoboru odporności myszy TK-NOG należy hodować, trzymać i obchodzić się z nimi w warunkach aseptycznych.
- Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze na buty i maskę na twarz, aby zapobiec zakażeniu potencjalnie chorobotwórczymi mikroorganizmami.
- Do operacji należy używać sterylnych rękawic i narzędzi oraz obchodzić się ze zwierzętami w sposób aseptyczny przez cały czas trwania zabiegu.
- Wybór myszy TK-NOG do eksperymentu
- Utrzymuj kolonię szczepu TK-NOG poprzez hodowlę samic myszy TK-NOG z samcami rodzeństwa z miotu innych niż TK-NOG i wybierz transgeniczne potomstwo przez genotypowanie.
nuta: Przeprowadzić genotypowanie (patrz krok 3.3) w celu określenia obecności lub braku transgenu u nowonarodzonych samców i samic myszy w momencie odsadzenia.
- Wybieraj samców w wieku 6-8 tygodni do przeszczepu ze względu na ich wysoką wrażliwość na zmniejszenie hepatocytów eksprymujących transgen HSV-TK za pośrednictwem GCV.
- Zakolczykuj uszy myszy w momencie odsadzenia od piersi lub operacji, aby ułatwić identyfikację. Zanotuj wagę i stan zdrowia zwierząt.
- Genotypowanie na obecność transgenu HSV-TK przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym
- Genotypowanie należy wykonać w momencie odsadzenia (zwykle w wieku 3-4 tygodni). W celu genotypowania wytnij kawałek ucha myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność i wyodrębnić genomowe DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA.
- Amplifikować genomowe DNA wyekstrahowane z słuchawki w mieszaninie reakcyjnej o stężeniu 20 μl w celu przeprowadzenia badania przesiewowego transgenu HSV-TK pod kontrolą ludzkiego promotora albuminy poprzez dodanie 1 μl startera do przodu 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL startera odwrotnego 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL sondy FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', i 10 μl mieszanki wzorcowej na przyrządzie do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym.
- Ustaw ustawienia PCR w czasie rzeczywistym w następujący sposób: 60 °C przez 30 s (etap wstępnego odczytu), 95 °C przez 10 minut (etap wstrzymania), 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę (etap PCR) i 60 °C przez 30 s (etap po odczytu).
nuta: Cykl progu (Ct) poniżej 22 jest uważany za dodatni dla transgenu HSV-TK.
- Leczenie z użyciem gancyklowiru i treosulfanu
- Za pomocą igły 27 G wstrzyknij myszom TK-NOG dootrzewnowe wstrzyknięcia GCV (6 mg / kg) 2 razy dziennie w 7 dniu i w 5 dniu w 100 μl soli fizjologicznej przed zabiegiem w celu wyczerpania transgenicznych komórek miąższowych myszy (jak pokazano w strategii eksperymentalnej na rycinie 2).
- W dniach 3, 2 i 1 przed operacją należy wstępnie przygotować myszy za pomocą niemieloablacyjnych dootrzewnowych dawek treosulfanu (1,5 g / kg / dzień) w 100 μl soli fizjologicznej, używając igły 27 G.
- Na dzień przed zabiegiem należy pobrać dwie do trzech kropli (~100 μl) krwi z żyły podżuchwowej, nakłuwając ją lancetem o średnicy 5 mm, i wyizolować surowicę przez odwirowanie (1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C) do testu aminotransferazy alaninowej (ALT) w celu oceny stopnia uszkodzenia wątroby.
- Przygotowanie do zabiegu
- Użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić sierść myszy otaczającą miejsce nacięcia (po lewej stronie ściany otrzewnej) przed zabiegiem.
- Dostosuj przepływ tlenu do 1 l/min, a przepływ izofluranu do 3% - 5% w komorze indukcyjnej za pomocą urządzenia do znieczulania myszy. Umieszczaj jedną mysz na raz w komorze indukcyjnej w celu znieczulenia.
- Podłączyć jeden koniec sterylnej probówki przedłużającej (o pojemności 550 μl zawiesiny; specyfikacje znajdują się w Tabeli Materiałów) do igły 30 G, a drugi koniec do strzykawki o pojemności 1 ml.
- Napełnić strzykawkę zawiesiną (80 μl/mysz) połączonych HEP i HSPC (patrz punkt 2), umieścić strzykawkę w nacięciu powtarzalnej pipety dozującej i wyregulować dozownik tak, aby dozował 10 μl w każdym naciśnięciu.
- Po znieczuleniu myszy (zwykle po 3 - 4 minutach) przełącz przepływ izofluranu na stożek nosowy i zmniejsz szybkość przepływu izofluranu do 2% - 3%.
- Przeszczepienie do śledziony ludzkich HSPC i hepatocytów u myszy
- Wszystkie etapy operacji należy wykonać w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
- Umieścić czystą, sterylną serwetę na powierzchni roboczej i wyszorować lewą stronę ciała każdej myszy 10 % jodowidonu, a następnie 70 % alkoholu izopropylowego, przed wykonaniem nacięcia.
- Wykonaj małe nacięcie (~1 - 1,5 cm długości i 5 mm głębokości) w skórze, mięśniach i otrzewnej po lewej stronie ściany otrzewnej nożyczkami typu Vanna, aby wejść do jamy otrzewnej około 5 mm poniżej dolnej krawędzi klatki piersiowej.
- Zlokalizuj śledzionę, pociągnij ją lekko kleszczami do obszaru operacyjnego, aby uzyskać łatwy dostęp, i włóż igłę 30 G w dolny biegun śledziony.
- Odblokuj tłok pipety dozującej i dozuj jednorazowo 10 μl objętości, z ograniczeniem do 60-80 μl na śledzionę. Powoli cofnąć igłę i przyciąć śledzionę klipsami do podwiązywania za pomocą aplikatora do podwiązywania.
- Wepchnij śledzionę z powrotem do jamy ciała za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką zwilżonych sterylnym PBS.
- Zamknij warstwę mięśniową ściany brzucha za pomocą wchłanialnego szwu przerywanego wzoru szwów (nie ciągłego). Osiągnij zamknięcie skóry za pomocą przerwanego wzoru szwów za pomocą szwów niewchłanialnych.
