1. Generowanie i walidacja jednołańcuchowych przeciwciał Fab (scFab)-CARs.
UWAGA: CAR zazwyczaj zawierają 3 domeny krytyczne - domenę ukierunkowaną na antygen, domenę dystansową/transbłonową i domenę sygnalizacji cytoplazmatycznej. Dokładny projekt każdego CAR zależy od zamierzonego celu, a zatem, poza kluczowymi cechami konstruktu istotnymi dla generacji retrowirusa, nie zostanie szczegółowo opisany w niniejszym protokole. Ogólny projekt CAR wykorzystanych w badaniach opisanych poniżej przedstawiono na rysunku 1. Krótko mówiąc, domena celowa obejmuje cały łańcuch lekki i domenę zmienną oraz domenę CH1 łańcucha ciężkiego z macierzystego przeciwciała monoklonalnego połączonego półsztywnym łącznikiem. Domena dystansowa / transbłonowa pochodzi z mysiego CD28, a domena sygnalizacyjna to fuzja zawierająca pierwiastki z mysich CD28, CD137 (4-1BB) i CD247 (CD3ζ). Pierwiastki te są składane za pomocą standardowych procedur biologii molekularnej, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy nakładającej się na splot (PCR) lub synteza odpowiedniego "bloku genu". Szczegóły dotyczące generacji mAB287 CAR są zawarte w Zhang et al. Sekwencje cDNA można uzyskać od autorów na życzenie.
- Montaż konstrukcji CAR
- Zsyntetyzuj oddzielnie celujące jednołańcuchowe przeciwciało Fab (scFab) i połączone domeny dystansowe/sygnalizacyjne, a następnie użyj techniki ligacji "3-punktowej" do złożenia końcowego konstruktu (ryc. 1).
UWAGA: Kluczowym wymaganiem dla wstawki CAR jest to, że powinna ona zawierać flankujące miejsca endonukleazy restrykcyjnej, umożliwiające ligację do retrowirusowego wektora ekspresyjnego pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) lub pokrewnej pochodnej.
- Walidacja wyrażenia powierzchni CAR
- Transdukuj komórki hybrydoma za pomocą cząstek retrowirusowych pochodzących z pMIG II, generowanych przez standardowy protokół (np. Holst i wsp.).
- Uruchom analizę cytometrii przepływowej, aby wykryć ekspresję GFP z wektora CAR.
- Wybarwić ekspresję powierzchniową CAR transdukowanych hybrydomów przy użyciu znakowanych przeciwciał przeciwko mysiemu łańcuchowi κ (np. klon RMK-45).
- Walidacja swoistości CAR
- Stymulować transdukowane komórki hybrydoma odpowiednimi antygenami związanymi z płytkami lub antygenami komórkowymi. Po całonocnej wspólnej hodowli zebrać supernatanty i wydzielane cytokiny, a następnie oznaczyć za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).
UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby każdy CAR został niezależnie zweryfikowany przed użyciem do transdukcji. Na tym etapie eksperyment może zostać wstrzymany i ponownie uruchomiony później.
2. Transfekcja komórek producenta wirusa (dzień - 4 do dnia 3)
UWAGA: Retrowirus jest wytwarzany przy użyciu komórek Phoenix-ECO (zobacz Tabelę Materiałów). Należy stosować odpowiednie środki ostrożności w celu wytworzenia potencjalnie zakaźnych czynników (najlepiej w tym wyznaczoną szafkę poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) i oddzielny inkubator do hodowli transfekowanych/wyduplikowanych komórek).
- Rozmrażanie komórek Feniksa (dzień -4)
- Rozmrozić 2 x 106 ogniw Phoenix-Eco. Zwiększ liczbę komórek Phoenix, jeśli planowane jest wiele transdukcji.
- Umieść je w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z 10 ml pożywki (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS)).
- Komórki Passage Phoenix (Dzień -3)
- Usunąć pożywkę i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
- Dodać 3 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 10% CO2 przez 3 minuty.
- Zbierz komórki, a następnie osadź przez odwirowanie przez 3 minuty przy 200 x g. Ponownie rozszczepić komórki w 10 ml świeżej pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C.
- Napromienianie komórek Feniksa (dzień -1 po południu)
- Aby zminimalizować dalszy podział komórek, zbierz komórki Feniksa zgodnie z opisem w kroku 2.2, ponownie zawieś w 5 ml pożywki i naświetlaj komórki promieniami gamma na lodzie (1000 rad).
UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas prac związanych z promieniowaniem, aby uniknąć narażenia personelu.
- Odwirować napromieniowane komórki, zawiesić ponownie w świeżej pożywce, rozmieścić na płytce 2 x 106 komórek (w 10 ml pożywki)/płytkę/CAR i inkubować.
- Transfekcja (Dzień 0 - rano)
- Odessać supernatant z komórek Phoenixa, przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i ostrożnie dodać kroplami 7 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM) do bocznej ścianki płytki, aby uniknąć naruszenia monowarstwy. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora.
- Weź dwie probówki polipropylenowe o pojemności 14 ml z okrągłym dnem i dodaj do każdej 1,5 ml zredukowanej pożywki surowicy. Do jednej probówki dodać 40 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów).
- Do drugiej probówki dodać 15 μg plazmidu Ab-CAR (wygenerowanego w kroku 1) i 5 μg plazmidu otoczkowego i opakowaniowego (5 μg pCL-Eco). Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Dodać mieszaninę odczynników do transfekcji z kroku 2.4.2 kroplami do drugiej probówki, nie dotykając boków probówki, i wymieszać, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół 3 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.
- Dodać kroplami 3 ml mieszaniny do komórek Feniksa i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych.
- Po 4–5 godzinach dodać 1 ml FCS. Hodowla komórek przez noc w temperaturze 37 °C.
- Średnia zmiana (dzień 1)
- Usunąć supernatant zawierający kompleksy plazmid/odczynnik do transfekcji i usunąć je zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi postępowania z materiałem zakaźnym. Dodaj 4 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do komórek.
- Żniwo wirusa do transdukcji (dzień 2)
- Zebrać pożywkę zawierającą wirusa z komórek Phoenixa za pomocą sterylnej strzykawki, przefiltrować (0,45 μm) w celu usunięcia resztek komórek i zebrać w nowej probówce.
- Dodać rekombinowaną ludzką interleukinę-2 (rhIL-2) do końcowego stężenia 200 jednostek międzynarodowych (j.m.)/ml. Wirusa należy natychmiast użyć do transdukcji (krok 5.3). Dodaj 4 ml świeżej pożywki do komórek Phoenixa i umieść w inkubatorze.
- Powtórz zbieranie wirusów (dzień 3)
- Powtórz krok 2.6, ale odrzuć komórki Phoenix jako odpad zakaźny, zamiast dodawać świeżą pożywkę. Ten supernatant jest używany w kroku 5.4.
3. Izolacja i aktywacja pierwotnych limfocytów T CD8 (dzień -1 do dnia 0)
UWAGA: Poprzednio, pobieraj limfocyty T CD8 od samic myszy z cukrzycą (NOD) po 4-5 tygodniach, czyli w momencie poprzedzającym rozpoczęcie zapalenia wysp trzustkowych. Ze wszystkimi myszami należy obchodzić się zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Limfocyty T CD8 są wzbogacane ze splenocytów przy użyciu komercyjnego zestawu do selekcji negatywnej.
- Powlekanie płytek przeciwciałami CD3/CD28 (dzień -1)
- Dodać 1 ml mieszaniny przeciwciał anty-mysich CD3 i CD28 (oba w stężeniu 1 μg/ml w PBS) do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
- Następnego dnia należy przemyć płytki 1 ml sterylnego PBS 3 razy przed dodaniem mysich limfocytów T CD8 (krok 4.1).
UWAGA: Liczba studzienek, które mają być pokryte, będzie się różnić dla każdego eksperymentu, w zależności od całkowitej wymaganej liczby aktywowanych limfocytów T CD8.
- Zbiór splenocytów (dzień 0)
- Poddaj eutanazji dwie samice myszy NOD w wieku 4-5 tygodni za pomocą inhalacji CO2 , a następnie dekapitacji. Zbierz śledziony i umieść je na sitku do komórek, namoczonym w 10 ml PBS w naczyniu do hodowli komórkowych na lodzie.
- W kapturze do hodowli komórkowej pokrój każdą śledzionę na 3-5 kawałków, dociśnij tkanki sterylnym tłokiem strzykawki o pojemności 3 lub 5 ml, aby rozsunąć fragmenty śledziony i umożliwić komórkom przejście przez drucianą siatkę.
- Delikatnie usuń czerwone krwinki, ponownie zawieszając splenocyty w rozcieńczonym w stosunku 1:4 buforze do lizy krwinek czerwonych (1 ml buforu do lizy w 3 ml PBS na jedną śledzionę) i inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Następnie rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek roztworem barwnika trypanowego do zliczania komórek za pomocą hemocytometru, a resztę komórek zagnieździć przez odwirowanie przy 350 x g przez 7 minut.
- Wzbogacenie limfocytów T CD8 (dzień 0)
- Wzbogać limfocyty T CD8 przez selekcję negatywną za pomocą mysiego zestawu do izolacji limfocytów T CD8, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Aby zapewnić wysoką czystość, zawsze zaokrąglaj liczbę komórek w górę podczas obliczania objętości biotynylowanego przeciwciała, które ma zostać dodane (np. użyj objętości odczynników sugerowanej dla 108 komórek dla obliczonych 9,1 x 107 komórek).
- Zawiesić osady komórkowe w 400 μl buforu i 100 μl koktajlu biotyna-przeciwciało na 1 x 108 komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w lodówce (4 °C), aby umożliwić związanie przeciwciał.
- Dodać 300 μl buforu do znakowania i 200 μl mikrokulek antybiotyny na 1 x10 8 komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- W oczekiwaniu na wiązanie mikrokulek ustaw kolumnę separacyjną na separatorze. Przemyć kolumnę, przepłukując ją 3 ml buforu do etykietowania.
- Przepuścić 1000 μl mieszaniny kulek/komórek przez sitko o wielkości 40 μm przed załadowaniem do kolumny separacyjnej w celu usunięcia agregatów komórkowych. Zebrać przepływ z kolumny do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 ml.
- Umyj kolumnę zgodnie z instrukcją producenta, zbierając wszystkie ścieki do tej samej rurki. Oznaczyć liczbę komórek (tak samo jak w kroku 3.2.4) i zbierać przez odwirowanie w stężeniu 350 x g przez 5 minut. Przemyć komórki przez ponowne zawieszenie w 2 ml kompletnej pożywki z limfocytów T (RPMI-1640 zawierającej FCS, 2-merkaptoetanol, rhIL-2 (200 U/ml), mysią interleukinę-7 (mIL-7, 0,5 ng/ml), ITS, kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) i penicylinę-streptomycynę) i odwirowanie przy 350 x g przez 5 min.
- Zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym (37 °C) kompletnym podłożu limfocytów T o stężeniu 0,25–0,5 x 106/ml.
4. Aktywacja limfocytów T (Dzień 0 do 2)
- Dodać 2 ml zawiesiny komórkowej (0,25–0,5 x 106/ml) do każdej powlekanej studzienki 24-dołkowej płytki pokrytej przeciwciałem CD3/CD28 od kroku 3.1.2. Użyj ruchu wirowego, aby równomiernie dozować komórki.
UWAGA: Dodaj komórki ruchem wirowym, aby równomiernie je rozprowadzić i zminimalizować efekty krawędzi. Jeśli komórki skupią się wzdłuż krawędzi studzienek, zarówno szybkość transdukcji, jak i żywotność komórek zostaną zmniejszone.
- Jako kontrolę, umieść tę samą liczbę limfocytów T CD8 w pojedynczym niepowlekanym dołku płytki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z gazem o stężeniu 10% CO2 przez 48 godzin
UWAGA: Po 48 godzinach aktywację można potwierdzić za pomocą mikroskopu; aktywowane komórki będą większe niż komórki, które nie napotkały przeciwciał anty-CD3/CD28.
5. Transdukcja aktywowanych limfocytów T CD8 (dni od 1 do 3)
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje metodę transdukcji spinowej. Wymagana jest wirówka z odchylanym rotorem i adapterami do kultur tkankowych, która jest w stanie utrzymać temperaturę wewnętrzną 37 °C. Aby zapewnić maksymalną wydajność, w dniu transdukcji należy wstępnie ogrzać wirówkę do temperatury 37 °C przed zebraniem wirusa.
- Przygotowanie płytek pokrytych ludzkim fragmentem fibronektyny (dzień 1 do dnia 2)
- W pierwszym dniu dodać 0,5 ml fibronektyny (50 μg/ml w PBS) do dołków 24-dołkowej płytki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Zazwyczaj wymagane są dwie studzienki pokryte fibronektyną na płytkę transfekowanych komórek Phoenix.
- W 2 dniu usuń roztwór fibronektyny i zastąp go 1 ml 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby "zablokować" niespecyficzne miejsca wiązania.
- Umyj poddane działaniu studzienek 1 ml sterylnego PBS. Po usunięciu roztworu myjącego płytka jest gotowa do użycia; lub mogą być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
- Pobranie aktywowanych limfocytów T CD8 (dzień 2)
- Pobrać aktywowane limfocyty T CD8, policzyć i obliczyć żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego lub odpowiedniego automatycznego urządzenia.
- Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić w temperaturze 5 x 106 żywych komórek/ml w celu transdukcji. Utrzymać małą porcję komórek w hodowli w kompletnej pożywce z limfocytów T w inkubatorze CO2 w celu zapewnienia kontroli dla późniejszego sortowania komórek transdukowanych przez fluorescencję aktywowanych fluorescencją (etap 6).
UWAGA: Po aktywacji przez 48 godzin całkowita liczba komórek powinna wzrosnąć około 1,5 raza i mieć żywotność większą niż 95%.
- Transdukcja (dzień 2)
- Dodaj 100 μl aktywowanej zawiesiny komórek CD8 na studzienkę (0,5 x 106 komórek) do płytki pokrytej fibronektyną. Następnie dodaj 1,5-2 ml pożywki zawierającej wirusa (z kroku 2.6) do każdej studzienki. Wymieszaj ruchem wirowym, aby równomiernie dozować komórki (ryc. 2).
- Umieść płytkę w plastikowej torbie z zamkiem błyskawicznym i zamknij (w celu zapewnienia wtórnej hermetyzacji). Wirować przy 2000 x g przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
- Wyjmij płytkę z wirówki. W przypadku bezpieczeństwa biologicznego szafka ostrożnie wyjmij plastikową torbę i upewnij się, że zewnętrzna strona płytki nie jest zanieczyszczona żadnym medium.
- Następnie przenieść płytkę do dedykowanego inkubatora CO2 o temperaturze 37 °C. Po 4 godzinach usuń 1 ml pożywki z każdej studzienki i zastąp 1 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki z komórek T. Wymień płytkę w inkubatorzeCO2.
UWAGA: Wszystkie media z transdukowanych komórek należy traktować jako odpady zakaźne.
