1. Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego z bakteriami i koktajlem fagowym
UWAGA: Aby przeprowadzić infekcję ogólnoustrojową, zarodek musi mieć krążenie krwi, które zwykle zaczyna się po 26 hpf.
- Po 26 hpf zdekorionować zarodki roztworem pronazy przygotowanym przez rozpuszczenie proszku pronazy w pożywce E3 w stężeniu 2 mg/ml. Delikatnie odpipetuj zarodki, aby przerwać kosmówkę. Wyrzuć pożywkę pronazy/E3 i kilkakrotnie opłucz naczynie świeżym E3, aby usunąć całą pronazę.
- Znieczulić zarodki danio pręgowanego w pożywce E3 zawierającej trikainę na około 5 minut przed wstrzyknięciem.
- Odpipetować znieczulone zarodki do toru przygotowanego w kroku 1. Użyj cienkiej końcówki ładującej żel, aby wyłożyć zarodki w pozycji bocznej.
- Na igłę do mikroiniekcji należy wlać około 5 μl preparatu P. aeruginosa.
- Wbić igłę grzbietowo do punktu początkowego przewodu Cuviera, gdzie zaczyna rozprowadzać się po woreczku żółtkowym. Wstrzyknąć objętość 1-3 nL i upewnić się, że objętość rozszerza się bezpośrednio w kanale i wchodzi do krążenia.
- Mniej więcej po każdych 50 wstrzykniętych zarodkach wstrzyknij kroplę bakterii do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml ze 100 μl sterylnego PBS, aby sprawdzić, czy objętość wstrzykniętego zarodka pozostaje taka sama. Umieścić inokulum na agarze LB (patrz Tabela 1) w temperaturze 37 °C przez noc w celu oceny CFU.
- Przenieść zarodki z mikrowstrzykniętymi zarodkami na dwie czyste płytki Petriego ze świeżą pożywką E3 + PTU (tabela 1) i inkubować w temperaturze 28 °C.
- W dwóch wybranych punktach czasowych: 30 minut lub 3 godziny po wstrzyknięciu bakterii, wyjąć z inkubatora jedną z szalek Petriego z zarodkami wstrzykniętymi bakteriami i ustawić je na ścieżce opisanej w ppkt 6.3 w celu wstrzyknięcia koktajlu fagowego.
- Załadować igłę do mikroiniekcji około 5 μl koktajlu fagowego (mieszanina czterech fagów, które infekują szczep PAO1) końcówką ładującą drobny żel i przymocować ją do mikroiniektora.
- Koktajl fagowy należy wstrzyknąć do przewodu Cuviera z zarodków, którym wcześniej wstrzyknięto bakterie.
- Przenieść zarodki z mikrowstrzykniętymi zarodkami na dwie czyste płytki Petriego ze świeżą pożywką E3 + PTU i inkubować je w temperaturze 28 °C.
Tabela 1: Przygotowanie roztworów
| Rozwiązania | preparat |
| Podstawowy roztwór znieczulający 25X | 4 mg/ml trikainy w destylowanym H2O. |
| Anestezjologiczne rozwiązanie robocze 1X | rozcieńczyć w destylowanym H2O roztwór podstawowy trikainy 25X preparat, aby osiągnąć 1X stężenie (0,16 mg/ml) Trikainy destylowanego H2O. |
| CsCl d=1,3 | 20,49 g w 50 ml TN |
| CsCl d=1,4 | 20,28 g w 50 ml TN |
| CsCl d=1,5 | 34,13 g w 50 ml TN |
| CsCl d=1,6 | 41,2 g w 50 ml TN |
| Pożywka zarodkowa E3 dla zarodka danio pręgowanego | 1 L 1of E3 (rozcieńczyć 50X wywar destylowanym H2O) + 200 μl 0,05% błękitu metylowego. Sklep w RT. |
| E3 pożywka dla zarodków roztwór podstawowy (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 i 9,95 g MgSO4 w 5 l destylowanego H2O. Sklep w RT. |
| Agar LB | 10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 5 g/L NaCl, 10 g/L agaru |
| Rosół LB | dla 1L: 950 ml H2O, 10 g Tryptonu, 10 g NaCl, 5 g Ekstrakt drożdżowy |
| Biblioteka PBST (PBST | PBS 1X + Tryton X 1% |
| Roztwór fizjologiczny | 0,9% NaCl |
| Roztwór podstawowy blokujący pigmentację 10X | 0,3 mg/ml fenylotiomocznika (PTU) w proszku w pożywce E3 dla zarodków danio pręgowanego |
| Roztwór podstawowy Pronase 5X | 5 mg/ml pronazy w proszku w pożywce E3 dla zarodków danio pręgowanego |
| Bufor TN | 10 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl |
