Wstrzyknięcie osocza bogatopłytkowego do przeciętego ścięgna Achillesa szczura

Streszczenie

Źródło: Greimers, L., et al. Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia ciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę wstrzykiwania osocza bogatopłytkowego (PRP) do przeciętego ścięgna Achillesa u szczurów. Mały segment jest wycinany ze ścięgna Achillesa szczura biorcy, miejsce jest zszywane, a szczur może wyzdrowieć. Jednocześnie krew pełna jest pobierana od szczura dawcy i odwirowywana w celu uzyskania PRP, który jest następnie aktywowany i wstrzykiwany w miejsce zszycia szczura biorcy w celu wywołania naprawy ścięgien.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Użyj 132 2-miesięcznych samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 320-450 g (120 szczurów do eksperymentów i 12 szczurów do pobierania krwi, ryc. 1). Piętnaście szczurów w każdej grupie wystarczyło do uzyskania potęgi 0,8 (80% szansy na znalezienie istotności statystycznej, jeśli określony efekt istnieje).
2. Trzymaj wszystkie szczury w klasycznych klatkach w warunkach izolacji w konwencjonalnym obiekcie wyposażonym w przebieralnię. Zainicjuj hodowlę w stojaku IVC (indywidualnie wentylowana klatka), przy czym szczury SPF (wolne od specyficznych patogenów) są specjalnie kupowane.
3. Stosować w następujących warunkach mieszkaniowych: zakres temperatur od 19-24 °C; wilgotność względna: 40-60%; wentylacja: częstotliwość wymiany powietrza: 10-15 na godzinę; cykl jasny/ciemny: 12 h-12 h.
4. Wysterylizuj wszystkie urządzenia do trzymania w klatkach i użyj napromieniowanej ściółki. Systematycznie wdrażaj wzbogacanie klatek, umieszczając w nich sterylne tacki kartonowe i ręczniki.
5. Zezwól na wejście do strefy w ograniczonych warunkach: nowy fartuch laboratoryjny, maska, rękawice, obuwie i czepek do włosów przy wejściu.
6. Corocznie należy przeprowadzać monitorowanie stanu zdrowia kolonii zwierząt wskaźnikowych trzymanych na brudnej ściółce, zgodnie z zaleceniami Felasa dla konwencjonalnych obiektów. Trzymać od czterech do pięciu zwierząt w klatce z odpowiednią napromieniowaną dietą i dostarczać zakwaszoną wodę ad libitum. Monitoruj codziennie.
7. Szczury transferowe wybrane do interwencji chirurgicznej w filtrowaniu górnych klatek do sal operacyjnych na 2 godziny przed zabiegiem.

2. Zabieg chirurgiczny

1. Przygotuj narzędzia chirurgiczne: cienkie nożyczki, zacisk, dwa zaciski hemostatyczne i uchwyt na igłę. Podczas wszystkich zabiegów należy nosić rękawiczki, maskę, kaptur i fartuch laboratoryjny.
2. Losowo podziel szczury na dwie grupy (PRP i roztwór soli fizjologicznej).
3. Wyjmij szczura z klatki i zważ go. Użyj ponumerowanych kolczyków, aby zidentyfikować szczury. Aby uniknąć wysuszenia oczu, umieść krople wody na rogówce.
4. Znieczulić szczura dootrzewnowo ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała). Umieścić zwierzęta pod monitorowaniem krążeniowo-oddechowym, aby potwierdzić znieczulenie i sprawdzić, czy nie ma odruchów wzrokowych.
5. Wstrzyknąć 50 μl buprenorfiny podskórnie (0,01-0,05 mg/kg co 8-12 h) w okolicę szyi jako środek przeciwbólowy.
6. Ogolić lewą tylną kończynę golarką elektryczną, zdezynfekować ją 3 naprzemiennymi peelingami roztworu izobetadyny/alkoholu (rozcieńczonego w stosunku 1:10) i umieścić szczura na ciepłym podkładce (20 °C) pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść szczura na bocznym odleżynie z nogą, która ma być operowana, w pozycji nadrzędnej. Przytrzymaj łapę kleszczami chirurgicznymi.
7. Za pomocą nożyczek wykonaj małe boczne nacięcie (20-25 mm) w skórze otaczającej lewe ścięgno Achillesa i wypreparuj powięź za pomocą cienkich nożyczek, aby odsłonić kompleks ścięgna Achillesa (ryc. 2a).
8. Usuń ścięgno podeszwowe nożyczkami (ryc. 2b).
9. Przetnij ścięgno Achillesa poprzecznie 5 mm proksymalnie do przyczepu piętowego i usuń część o długości 5 mm za pomocą nożyczek. Nie zszywać ścięgna (ryc. 2c, 2d).
10. Zszyj powięź i skórę przędzą wchłanialną, wykonując szew overjet (szew ciągły). Szwy monofilamentowe mogą również zapobiegać przenikaniu ze skóry do nacięcia chirurgicznego.
11. Umieść szczura pod lampą grzewczą do momentu obudzenia, a następnie umieść go z powrotem w klatce (58 x 38 cm) (Nota bene: nie nakłada się unieruchomienia).

3. Przygotowanie do PRP

1. Znieczulić szczury dawcy ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Iniekcja PRP przeprowadza się 2 godziny po operacji bez konieczności znieczulenia.
2. Wstrzyknąć podskórnie 50 μl buprenorfiny jako środek przeciwbólowy.
3. Zebrać krew pełną (20 ml na szczura, końcowe krwawienie) przez nakłucie serca do sterylnych probówek zawierających 3,2% buforowany cytrynian sodu (0,109 M, antykoagulant). Następnie poddaj szczura eutanazji przez wstrzyknięcie dosercowe.
4. Aby uzyskać PRP, należy odwirować krew przez 10 minut w temperaturze 150 x g i temperaturze pokojowej. Ten początkowy etap wirowania z niską prędkością daje dwie odrębne fazy: dolną fazę składającą się z czerwonych krwinek (RBC), która stanowi około 80-90% całkowitej objętości i górną fazę składającą się z osocza bogatopłytkowego (PRP) (zwykle 10-20% próbki krwi).
5. Zebrać PRP (górną fazę) w wtórnej plastikowej probówce za pomocą plastikowej pipety transferowej. Ponieważ interfejs między PRP a czerwonymi krwinkami jest bardzo luźny, nie należy pipetować zbyt blisko interfejsu. Przy prawidłowym obchodzeniu się z zanieczyszczonymi erytrocytami w PRP powinno być poniżej 0,05 x 10³ komórek/μl. Wyrzuć pozostałą dolną fazę i probówkę do pobierania krwi pierwotnej.
6. Określ objętość pobranego PRP i zmierz liczbę płytek krwi na analizatorze hematologicznym. Wartości te są wymagane do obliczeń w celu dostosowania stężenia płytek krwi w następnym kroku. Liczba krwinek jest również pomocna w ocenie potencjalnego zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi i białymi. Stężenie płytek krwi w PRP na tym etapie wynosi zwykle 1 – 1,5 x10⁶/μL.
7. Przeprowadzić drugie odwirowanie PRP przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze pokojowej. Ten szybki etap wirowania daje luźny osad płytek krwi i supernatant autologicznego osocza ubogiego w płytki krwi (PPP). Korzystając z wartości określonych w kroku 3.6, obliczyć objętość supernatantu, którą należy odrzucić w celu zagęszczenia PRP i osiągnięcia końcowego stężenia 2,5 x10⁶/μL.
8. Delikatnie zebrać supernatant (PPP) do wtórnej plastikowej probówki za pomocą plastikowej pipety transferowej, pozostawiając około dwóch trzecich końcowej objętości obliczonej w kroku 3.7. Ponieważ osad jest luźny, znaczna ilość płytek krwi jest tracona po odrzuceniu PPP, co może potencjalnie zmniejszyć pożądane stężenie.
9. Ostrożnie zawiesić osad płytek krwi z pozostałym supernatantem, delikatnie powtarzając pipetowanie. Zmierz liczbę płytek krwi na tym skoncentrowanym PRP. W razie potrzeby dodać odpowiednią objętość autologicznego PPP, aby osiągnąć końcowe stężenie docelowe.
   nuta: Osocze bogatopłytkowe należy zużyć w ciągu 3 godzin od przygotowania.
10. Dodać 50 μl CaCl₂ (11 mEq 10 ml) na ml PRP, aby aktywować płytki krwi
.
11. Wstrzyknąć 50 μl świeżego roztworu PRP lub soli fizjologicznej za pomocą igły 21G bezpośrednio w zszyte miejsce operacji po około 1 godzinie od przygotowania. W tym czasie PRP należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
12. Uważnie monitoruj powrót do sprawności szczurów w ciągu kilku dni po operacji i przed usunięciem ścięgna Achillesa.

Wyniki

Rysunek 1: Eksperymentalny projekt badania.

Rycina 2: Zabieg chirurgiczny.

(a) Kompleks ścięgien po usunięciu otaczającej powięzi.

(b) Usunięcie ścięgna podeszwowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ksylazyna (Xyl-M)	Vmd	żaden	Znieczulenia
Ketamin (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	żaden	Znieczulenia
Buprenorfina (Vetergésic Multidosis)	ALSTOE ALSTOE (Szpital)	żaden	Painkiller
izo-betadyna	MEDA-Pharma	żaden	Środek dezynfekujący
Przędza resorbowalna Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
Nembutal (Nembutal)	CEVA Santé Animale	żaden	Znieczulenia
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6148	Zachowuje strukturę tkanki
Izopropanol 100%	Firma VWR	2 09 22 364
Etanol 95%	Firma VWR	2,08,23,362
ksylen	Firma VWR	Numer katalogowy 28973.363
parafina	Firma VWR	LEIC3950.1006
Hematoksyliną	Milipory	1.15938.0025	Barwnik
Eozyną	Milipory	1.15935.0100	Barwnik
Eukitt powiedział:	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 3989	Medium montażowe
CaCl2