$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Synteza polimeru poli(beta aminoesterów) (pBAE) z końcowymi oligopeptydami (OM-pBAE)
- Polimeryzacja C6-pBAE
- Dodać 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-heksyloamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) do okrągłodennej szklanej kolby (100 ml). Następnie dodać diakrylan 1,4-butanodiolu (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Podgrzej wstępnie kąpiel oleju silikonowego w temperaturze 90 °C, umieść kolbę okrągłodenną w łaźni olejowej i mieszaj mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego przez noc (~18 h). Następnie wyjąć produkt z kolby okrągłodennej i umieścić go w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
nuta: Produkt ma postać lepkiego proszku i wyjmuje się go z kolby za pomocą szpatułki. Niezbędna jest walidacja struktury otrzymanego polimeru za pomocą 1H-NMR. Widma NMR zarejestrowano w instrumencie pracującym na częstotliwości 400 MHz (patrz tabela materiałów) przy użyciu chloroformu-d iD2Ojako rozpuszczalników. Pobrano około 10 mg każdego estru poli(β-aminowego) i rozpuszczono w 1 ml deuterowanego rozpuszczalnika.
- Reakcja z peptydami w celu otrzymania OM-pBAE
- Dodać 25 ml 0,1 M HCl do wybranych peptydów, np. peptydu Cys-His-His-His z kwasem trifluorooctowym (TFA, 200 mg), do uprzednio zważonej 50 ml probówki wirówkowej, która może wytrzymać liofilizację i ręcznie mieszać przez noc, aby uzyskać klarowny roztwór.
- Zamrozić roztwór w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę i zamrozić otrzymany chlorowodorek peptydu.
UWAGA: Sprawdź, czy ostateczna masa odpowiada wartości teoretycznej.
- Sporządzić roztwór C6-pBAE (0,031 mmol) w sultlenku dimetylu. Sporządzić również roztwór chlorowodorku peptydu (0,078 mmol) w dimetylosulfotlenku.
- Wymieszaj oba roztwory w zakręcanej tubce i przykręć nakrętkę. Mieszać roztwór mieszaniny w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze 25 °C przez 20 godzin za pomocą mieszadła magnetycznego.
- Dodać mieszaninę do eteru dietylowego/acetonu w stosunku 7:3 (v/v). Powstałą zawiesinę odwirować w temperaturze 25 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia rozpuszczalnika. Następnie dwukrotnie przemyć ciało stałe eterem dietylowym/acetonem w proporcji 7:3 (v/v). Następnie wysuszyć produkt w próżni (<0,2 atm).
- Sporządzić roztwór 100 mg/ml produktu w suloctlenku dimetylu. Otrzymany produkt nosi nazwę C6-peptide-pBAE. Niezbędna jest walidacja struktury otrzymanego polimeru za pomocą 1H-NMR, aby potwierdzić zanik sygnałów olefin związanych z końcowymi akrylanami. Jeśli polimer nie jest używany, można go zamrozić w temperaturze -20 °C.
2. Powstawanie polipleksów
UWAGA: Wszystkie procedury powinny być wykonywane w klimatyzowanym pomieszczeniu, aby utrzymać stałą temperaturę.
- Rozmrozić polimery C6-peptide-pBAE i wymieszać roztwór.
- Odpipetować polimer, wymieszać w górę i w dół i przygotować roztwór 12,5 mM (V1) w octanie sodu (NaAc). Następnie zmieszaj mieszaninę i odczekaj 10 minut.
- Przygotować informacyjny kwas rybonukleinowy (mRNA) w stężeniu 0,5 mg/ml i wymieszać pipetując (V2).
nuta: Bardzo ważne jest, aby unikać wirowania mRNA.
- Mieszaninę polimerów należy przetrząsnąć w wyniku końcowego stężenia, aby uzyskać jednorodny roztwór między substratem polimerowym w dimetylosulfotlenku (DMSO) a buforem octanowym .
nuta: Końcowe stężenie polimeru zależy od wybranego stosunku N/P (grup azotowych do fosforanowych). Stosunek N/P zależy od każdego konkretnego mRNA, które ma być użyte. Na przykład w przypadku wzmocnionej enkapsulacji białka zielonej fluorescencji (eGFP) zastosowano stosunek 25:1, jak wcześniej informowano.
- Zmieszać roztwór materiału genetycznego i roztwór peptydu C6-BAE (25x stężenia mRNA) w stosunku 1:1 (Vi = V1 + V2).
nuta: C6-peptide-pBAE jest ładowany do probówki mikrowirówkowej, w której mRNA jest dodawane przez pipetowanie w górę iw dół w celu wymieszania. Po przygotowaniu polipleks, kwas nukleinowy i stężenia peptydu C6-pBAE są rozcieńczane do połowy.
- Inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut w bloku termicznym. Wytrącić się wodą wolną od RNaz w stosunku 1:2, dodając próbkę do wstępnie załadowanej probówki wirówki z wodą.
- Dodać substancje pomocnicze. Dodać taką samą objętość jak mieszaninę mRNA i pBAE (Vi) w kwasie 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) 20 mM i sacharozie 4%, pipetując w górę iw dół. W tym momencie próbka została rozcieńczona 3x.
3. Liofilizacja polipleksów
- Natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C zamrażarkę poprzedniego roztworu polyplex przez 1 godzinę.
- Suszenie wstępne należy przeprowadzić, wykonując następujące czynności: (1) 1 h w temperaturze -60 °C i 0,001 hPa; (2) 1 h w temperaturze -40 °C i 0,0001 hPa; (3) 4 h w temperaturze -20 °C i 0,0001 hPa; (4) 12 h w temperaturze 5 °C i 0,0001 hPa.
- Przechowywać w temperaturze -20 °C natychmiast, aby uniknąć ponownego nawodnienia do czasu użycia.