1. Ekspresja samoorganizującego się rdzenia nanocząstek białkowych zawierających wiązkę sześciu helis (SHB-SAPN) w E. coli BL21(DE3)
- Zmieszać 95 ml składnika A i 5 ml składnika B pożywki w sterylnej szklanej kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 litrów, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Dodać ampicylinę do końcowego stężenia 100 μg/ml.
- Zaszczepić pożywkę bakterią E. coli z wcześniej ustalonej kultury podstawowej glicerolu. Inkubować kulturę w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obrotach na minutę (obr./min) przez 48 h.
UWAGA: Zastosowany zapas E. coli BL21 (DE3) zawierał wektor ekspresyjny oporny na ampicylinę z genem SHB-SAPN. Chociaż ogólny protokół pożywek zaleca 24 godziny inkubacji w temperaturze 37 °C, 48 godzin inkubacji w temperaturze 30 °C daje wyższą wydajność dla SHB-SAPN.
- Przenieść kulturę do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Odwirować probówki o stężeniu 4 000 x g przez 10 minut z wirnikiem o stałym kącie nachylenia w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i zachować osad do zebrania komórek.
UWAGA: Granulat komórkowy można natychmiast przetworzyć lub zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
2. Liza E. coli BL21(DE3) przez sonikację
UWAGA: Używaj niepirogennych naczyń z tworzywa sztucznego i szkła wypiekanych w temperaturze 250 °C przez co najmniej 30 minut. Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP), jako środek redukujący, rozbija wiązania dwusiarczkowe wewnątrz i między białkami. TCEP jest niezbędny dla podczas tego protokołu, jeśli wyświetlany antygen zawiera wiązania S-S. Tylko w przypadku rdzenia SHB-SAPN obecność TCEP w nie jest niezbędna.
- Przygotować bufor wolny od imidazolu (8 M mocznik, 50 mM fosforan sodu jednozasadowy, 20 mM zasada Tris, 5 mM TCEP) pH 8,0 (dostosowany za pomocą 5 N wodorotlenku sodu, NaOH) i przefiltrować go za pomocą jednostki filtracji butelkowej próżniowej 0,22 μm.
- Zawiesić granulowane komórki (od kroku 1.3) z 40 ml buforu wolnego od imidazolu w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Sonikować zawieszone komórki za pomocą sondy na lodzie przez 5 minut (4 s sonikacji, 6 s odpoczynku) z mocą sonikacyjną 150 W.
- Odwirować lizat komórkowy (40 ml) w temperaturze 29 000 x g w temperaturze 4 °C przez 25 minut w wirniku o stałym kącie w celu wytworzenia oczyszczonego supernatantu. Przenieść supernatant do sterylnej kolby o pojemności 150 ml i wyrzucić osad. Rozcieńczyć supernatant do objętości 100 ml przy użyciu buforu wolnego od imidazolu (w dalszej części protokołu określanego jako "próbka").
UWAGA: Ten etap rozcieńczania jest potrzebny, aby zapobiec zbyt wysokiemu ciśnieniu w układzie szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC) podczas ładowania lizatu na kolumnie.
3. Oczyszczanie białka za pomocą kolumny Hisa
UWAGA: Ten protokół został wykonany przy użyciu instrumentu FPLC, ale można go dostosować do przepływu grawitacyjnego.
- Przygotować następujące i przefiltrować je za pomocą jednostki filtracji butelkowej próżniowej o wielkości 0,22 μm: (i) bufor bezimidazolowy "bufor A" (8 M mocznik, 50 mM fosforan sodu jednozasadowy, 20 mM zasada Tris, 5 mM TCEP) pH 8,0; (ii) 500 mM bufor imidazolowy "Bufor B" (8 M mocznik, 50 mM fosforan sodu jednozasadowy, 20 mM zasada Tris, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol) pH 8,0; oraz (iii) płukanie izopropanolem (20 mM Tris, 60% izopropanolu) pH 8,0,
UWAGA: pH dla każdego buforu dostosowano za pomocą 5 N NaOH.
- Zrównoważ kolumnę Jego.
UWAGA: W przypadku produkcji na skalę laboratoryjną ten protokół wykorzystuje wstępnie zapakowaną kolumnę His o pojemności 5 ml, ale można użyć dowolnej kolumny o większym rozmiarze.
- Otwórz oprogramowanie FPLC i kliknij opcję Nowa metoda. Natychmiast otworzy się w menu ustawień metody. W menu rozwijanym dla pozycji kolumny wybierz port C1 3.
- Z menu rozwijanego Pokazane przez technikę wybierz powinowactwo. Z menu rozwijanego Typ kolumny wybierz inne, Histrap HP, 5 mL. Objętość kolumny i skrzynie ciśnieniowe zostaną automatycznie ustawione na odpowiednie wartości.
- Kliknij przycisk Konspekt metody. Przeciągnij następujące przyciski z menu kontekstowego Biblioteka faz: równowaga, przykładowe zastosowanie, mycie kolumny i elucja obok strzałki w tej dokładnie kolejności. Zamknij menu Biblioteka faz.
- Kliknij przycisk równoważenia. Wartości podane w tabeli to "bufor początkowy B" (4%), "bufor końcowy B" (4%) i "objętość (CV)" 5.
- Kliknij pole Przykładowa aplikacja. W polu ładowania próbki kliknij przycisk radiowy Wstrzyknij próbkę do kolumny z pompą do próbki. Upewnij się, że pole obok ustawień Użyj natężenia przepływu z metody jest zaznaczone w polu wtrysk próbki z pompą systemową. Obok pola głośności po prawej stronie ekranu zmień wartość na 20 ml.
- Kliknij przycisk Mycie kolumny. Wartości podane w tabeli to "bufor początkowy B" (4%), "bufor końcowy B" (4%) i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania ułamków odznacz pole Włącz.
- Kliknij przycisk elucji. Wartości podane w tabeli powinny to "bufor początkowy B" 0%, "bufor końcowy B" 100% i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania frakcji kliknij pole Włącz. Usuń zaznaczenie opcji Użyj wielkości frakcji z ustawień metody i dostosuj rozmiar frakcji do 4 ml w polu wypełniania poniżej.
- Kliknij przycisk Zapisz jako w górnej części oprogramowania. Nazwij plik "równoważność".
- Podłącz paczkowaną kolumnę His o pojemności 5 ml do odpowiedniego portu kolumny 3 w FPLC. Zarówno rurki pompy A, jak i pompy B, a także rurki pompy do pobierania próbek, należy umieścić w przefiltrowanej wodzie dejonizowanej o średnicy 0,22 μm. Uruchom program równoważenia.
- Umieścić zarówno pompę A, jak i pompę B, a także rurkę pompy próbki, w buforze wolnym od imidazolu (bufor A) i ponownie uruchomić protokół równoważenia.
- Związać próbkę z kolumną i oczyścić białko.
- Otwórz oprogramowanie FPLC i kliknij opcję Nowa metoda. Natychmiast otworzy się w menu ustawień metody. W menu rozwijanym Kolumna pozycja wybierz C1 port 3. Z menu rozwijanego Pokazane przez technikę wybierz opcję koligacja. Z menu rozwijanego typu kolumny wybierz inne, Histrap HP, 5 mL. Objętość kolumny i skrzynie ciśnieniowe zostaną automatycznie ustawione na odpowiednie wartości.
- Kliknij przycisk Konspekt metody. Przeciągnij przyciski z menu kontekstowego Biblioteka faz: równowaga, aplikacja próbki, mycie kolumny (Mycie 1), mycie kolumny (Mycie 2), mycie kolumny (Mycie 3) i elucja obok strzałki w dokładnie tej kolejności. Zamknij menu Biblioteka faz.
- Kliknij przycisk Równowaga. Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 4%, "bufor końcowy B" 4% i "objętość (CV)" 5.
- Kliknij pole Przykładowa aplikacja. W polu ładowania próbki kliknij przycisk radiowy dlapróbki I nject w kolumnie z pompą do próbki. Upewnij się, że pole obok opcji Użyj natężenia przepływu z ustawień metody jest zaznaczone w polu wtrysk próbki z pompą systemową.
- Obok pola głośności po prawej stronie ekranu zmień wartość na 100 ml. Obok schematu zbierania frakcji kliknij przycisk Włącz. Usuń zaznaczenie pola Użyj wielkości frakcji w ustawieniach metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
- Kliknij przycisk mycia pierwszej kolumny (Umyj 1). Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 4%, "bufor końcowy B" 4% i "objętość (CV)" 10. Obok schematu zbierania ułamków kliknij pole Włącz. Usuń zaznaczenie opcji Użyj wielkości frakcji z metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
- Kliknij przycisk mycia drugiej kolumny (Wash 2). Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 0%, "bufor końcowy B" 0% i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania ułamków kliknij pole Włącz. Usuń zaznaczenie opcji Użyj wielkości frakcji z metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
- Kliknij przycisk mycia trzeciej kolumny (Wash 3). Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 0%, "bufor końcowy B" 0% i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania frakcji kliknij przycisk Włącz. Usuń zaznaczenie pola Użyj wielkości frakcji w ustawieniach metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
- Kliknij przycisk Eliminacja. W tabeli po prawej stronie kliknij wymienione informacje, a następnie w wyświetlonym menu kliknij krok Usuń. Przeciągnij dwukrotnie przycisk gradientu izokratycznego na tabelę, tak aby były dwa wpisy.
- Wartość dla pierwszego wpisu powinna brzmieć "bufor początkowy B" 30%, "bufor końcowy B" 30% i "Objętość (CV)" 10. Wartość dla drugiego wpisu powinna brzmieć "bufor początkowy B" 100%, "bufor końcowy B" 100% i "objętość (CV)" 10. Obok schematu zbierania frakcji kliknij przycisk Włącz. Kliknij pole obok opcji Użyj rozmiaru ułamka z ustawień metody.
- Kliknij przycisk Zapisz w górnej części oprogramowania. Nazwij plik "oczyszczanie". Rurkę pompy A FPLC należy umieścić w buforze płuczącym bez imidazolu, natomiast rurkę pompy B należy umieścić w buforze imidazolowym 500 mM. Rurkę pompy do pobierania próbek należy umieścić w próbce o pojemności 100 ml.
- Uruchom program "oczyszczanie" i poczekaj na czas, w którym 60% izopropanol będzie potrzebny (Wash 2). Wstrzymaj program; przesunąć rurkę pompy A z mycia bez imidazolu do mycia 60% izopropanolu. Uruchom ponownie program.
- Po zakończeniu etapu izopropanolu ponownie wstrzymaj program i przejdź do rurki pompującej A z powrotem do buforu płuczącego bez imidazolu. Uruchom ponownie program oczyszczania (reszta przebiegu jest zautomatyzowana).
