Budowa humanizowanego modelu myszy z inżynieryjną odpornością na HIV

Streszczenie

Źródło: Zhen, A., et al. Inżynierska odporność oparta na komórkach macierzystych przeciwko zakażeniu wirusem HIV w humanizowanym modelu myszy. J. Vis. Exp. (2016).

Wideo demonstruje technikę generowania humanizowanego modelu myszy z opartą na komórkach macierzystych odpornością przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV). Ludzka tkanka grasicy płodu i zmodyfikowane hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są wszczepiane do torebki nerkowej myszy z poważnie obniżoną odpornością. HSC, które wyrażają chimeryczne receptory antygenowe (CAR) przeciwko wirusowi HIV, są mieszane w galaretowatej mieszaninie białek, która sprzyja ich kolokalizacji z tkanką grasicy. Po zabiegu HSC różnicują się w różne ludzkie komórki odpornościowe, w wyniku czego powstaje humanizowany model myszy z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym przeciwko HIV.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB. Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Budowa humanizowanych myszy z Chimerycznym Receptorem Antygenowym CD4

1. Przetwarzanie grasicy płodu i izolowanie HSC CD34+ z wątroby płodu
   1. Przetwarzanie grasicy
      1. Delikatnie umyj grasicę w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4, w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Powtórz krok prania 3 - 4 razy.
      2. Dodać 7 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + penicyliny/streptomycyny (Pen/paciorkowca). Przelej wszystko na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
      3. Za pomocą skalpeli pokrój grasicę na małe kawałki o wielkości około 1 mm². Umieść każdy kawałek grasicy w jednym dołku na 96-dołkowej płytce. Używaj zakrzywionych, kleszczy podczas przenoszenia kawałków grasicy na płytkę 96-dołkową.
         1. Dodaj niewielką ilość pożywki (100 - 200 μl) do wszystkich dołków, aby tkanka nie wyschła. Wizualizuj pod mikroskopem (te płaty mają płaty i powinny wyglądać jak worki komórek).
            nuta: Wyrzuć wszystkie elementy, które w jakikolwiek sposób wyglądają wątpliwie; Często występuje tkanka łączna, której nie należy wszczepiać.
      4. Usuń potwierdzone kawałki grasicy i umieść je wszystkie w kolbie do hodowli komórek T25. Dodać 7 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS i 450 μg/ml piperacyliny/tazobaktamu i amfoterycyny B. Delikatnie rozdrobnić kolbę do wymieszania. Hodowla kolby przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO₂,
         nuta: Ten krok jest wymagany, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu tkanki.
      5. (Krok opcjonalny) Zamroź grasicę do wykorzystania w przyszłości. Zrównoważ kawałki w 90% ludzkiej surowicy AB z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) przez 10 minut. Zamrozić je w temperaturze od 1 ºC/min do -50 ºC, a następnie szybko schłodzić do -150 ºC. Gdy będziesz gotowy do rozmrożenia, szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 ºC i delikatnie umyć 3x w kompletnych pożywkach RPMI bez DMSO.
   2. Przetwarzanie wątroby
      1. Delikatnie umyj wątrobę w PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Powtórz krok prania 3 - 4 razy.
      2. Dodać 10 ml Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przelej wszystko na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
      3. Homogenizuj tkankę wątroby za pomocą dwóch skalpeli. Pokrój wątrobę na małe kawałki o wielkości około 3 mm². Wytnij i wyrzuć białą tkankę łączną.
      4. Użyć strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 16 w celu pobrania kawałków wątroby i pożywki. Następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      5. Ponownie zawiesić pożywkę i zawiesinę tkankową i wydalić jeszcze 5-7 razy, aby całkowicie zhomogenizować tkankę.
      6. Przygotować 10 ml pożywki IMDM uzupełnionej enzymami: 500 U/ml kolagenazy, 2400 U/ml hialuronidazy i 300 U/ml DNazy, a także 450 μg/ml piperacyliny/tazobaktamu i amfoterycyny B. Przefiltrować pożywkę przez filtr 0,22 μm, a następnie dodać pożywkę do zawiesiny wątroby.
      7. Zakryć stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę wątroby i szczelnie zamknąć folią samouszczelniającą, taką jak Parafilm, aby zapobiec wyciekom. Obracać w rotatorze probówkowym w inkubatorze w temperaturze 37 ºC przez 90 minut.
      8. Przefiltrować rozpawioną zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 100 μm do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
         nuta: Dodać PBS do zawiesiny, aby zwiększyć całkowitą objętość do 50 ml. Podziel to na dwie probówki o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 25 ml zawiesiny komórek.
      9. Powoli i delikatnie podekryj komórki w każdej probówce pożywką wirówkową o gęstości 10 ml (np. Ficoll). Wirować z prędkością 1 200 x g przez 20 minut bez hamulca. Uwaga: wszystkie wirowania, o których mowa w niniejszym protokole, przeprowadza się w temperaturze pokojowej (25 ºC).
      10. Ostrożnie usunąć interfejs (tj. kożuch) z każdej probówki i przenieść do dwóch oddzielnych probówek o pojemności 50 ml. Doprowadzić objętość każdej probówki z interfejsem do 50 ml za pomocą PBS. Wirować z prędkością 300 x g przez 7 - 10 min. Ostrożnie odessać supernatant.
      11. Połącz dwa granulki. Przemyć jeszcze trzy razy 50 ml PBS zawierającego 2% FBS. Wirować z prędkością 300 x g przez 7 - 10 minut każdy, ostrożnie zasysając supernatant.
      12. Zawiesić granulat w 50 ml pożywki RPMI + 10% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru przed przystąpieniem do sortowania komórek.
      13. Zgodnie z protokołem producenta, komórki CD34+ należy sortować natychmiast za pomocą zestawu do sortowania CD34 (np. mikrokulek CD34).
          nuta: Alternatywnie, komórki można hodować przez noc w pożywce RPMI + 10% FBS przy 1 milionie/ml.
      14. Zapisz frakcje CD34+ i CD34-.
          nuta: Na tym etapie komórki CD34+ i CD34- można zamrozić za pomocą pożywki do zamrażania Bambanker lub innej pożywki do zamrażania. Zamrozić 1 ml 4 - 6 x 10⁶ komórek CD34+ w probówce i zamrozić 1 ml komórek 40 - 60 x 10⁶ CD34 w probówce.
2. Transdukcja komórek CD34+
   1. Oblicz liczbę dołków transdukcyjnych wymaganych dla 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Jedna studzienka może być użyta do transdukcji do 8 x 10⁶ komórek. Dla każdej myszy ze szpikiem kostnym/wątrobą/grasicą (BLT) zostanie wszczepione 0,5 x 10⁶ komórek CD34 + wraz z komórkami CD34 i grasicą pod torebką nerkową, a 0,5 x 10⁶ komórek CD34 + zostanie wstrzykniętych dożylnie. Liczba komórek CD34 + do użycia zależy od liczby myszy (1 milion komórek na mysz).
   2. Pokryj wymaganą liczbę 6-dołkowych dołków płytkowych niepoddanych hodowli tkankowej 1,25 ml rekombinowanego roztworu ludzkiej fibronektyny (np. Retronektyny) (20 μg/ml w PBS) do każdej studzienki. Przykryj płytkę i odstaw na 2 godziny w temperaturze pokojowej w czystej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   3. Odessać roztwór fibronektyny ze studzienek i dodać 1,25 ml buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (PBS z 4% FBS) do każdej studzienki w celu zablokowania. Odstawić płytkę w temperaturze pokojowej (25 ºC) na 30 minut.
   4. Odessać bufor FACS i przepłukać studzienki raz za pomocą PBS.
   5. Przechowywać PBS w powlekanych studzienkach do czasu, gdy płytka będzie gotowa do użycia. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 ºC przez noc, jeśli nie zostanie natychmiast użyta.
   6. Umieść komórki CD34 + w pożywce infekcyjnej (2% albuminy ludzkiej surowicy w pożywce z komórek T bez surowicy Yssela) w studzienkach pokrytych roztworem fibronektyny (~2 x 10⁶ komórek/ml) i inkubuj w temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę.
   7. Za pomocą pipety dodaj wektory lentiwirusowe do studzienek przy wielokrotności infekcji (MOI) między 2 a 10. Delikatnie wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze 37 ºC.
      nuta: Należy wcześniej określić miano zastosowanego wektora lentiwirusa.
   8. Zbierz komórki następnego dnia, delikatnie zeskrobując dno studzienek za pomocą skrobaka do komórek. Zbierz komórki i policz za pomocą hemocytometru.
   9. Aby przygotować komórki do implantu, połącz 0,5 x 10⁶ transdukowanych komórek CD34+ z 4,5 x 10⁶ komórek CD34- na mysz, podwielokrotność w sterylnych probówkach z zakrętką o pojemności 1,5 ml. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g do osadu i odessać supernatant. Odkręć je ponownie z prędkością 300 x g, odessać pozostały supernatant za pomocą pipety P10 i bardzo ostrożnie odessać. Utrzymuj suche granulki na lodzie przez cały czas trwania badania. nuta: Aby upewnić się, że komórki są zdolne do życia, użyj granulowanych komórek i wykonaj operację w ciągu 2-3 godzin.
   10. Aby przygotować komórki do wstrzyknięcia, należy obrócić 0,5 x 10⁶ transdukowanych komórek CD34 + na mysz w celu osadzenia i aspiracji supernatantu. Zawieś komórki w pożywce 100 μl RPMI na mysz i trzymaj na lodzie.
   11. Aby sprawdzić skuteczność transdukcji, podwielokrotność ~1 x 10⁵ nietransdukowanych i transdukowanych komórek CD34 + z każdego stanu i hodowla w pożywce cytokinowej 200 μl (pożywka RPMI z 10% FBS, uzupełniona 100 ng / ml ludzkiej IL-3, IL-6, SCF) na płytce 96-dołkowej przez 5 - 7 dni w temperaturze 37 ºC.
       nuta: Komórki użyte na tym etapie nie są wykorzystywane do operacji, ale w celu zapewnienia, że transdukcja zakończy się sukcesem, a wektor nie jest toksyczny dla przeżycia i odnowy komórek macierzystych. Wydajność transdukcji można sprawdzić, szukając ekspresji genów wektora (np. GFP&CD4) i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.
3. Przeszczepy tkanek w celu budowy genetycznie modyfikowanych myszy
   1. Tego samego dnia przed zabiegiem chirurgicznym wykonuje się napromienianie całego ciała NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) myszy z obniżoną odpornością z promiennikiem cezu-137 i dawką 2,7 Gy (270Rad).
      nuta: Myszy NSG mają poważnie obniżoną odporność. Dlatego ich utrzymanie i utrzymanie muszą być zgodne z najwyższymi standardami zdrowotnymi i obsługiwane przez wysoko wykwalifikowany personel.
   2. Wsypać kawałki grasicy i podłoże z kolby do naczynia o średnicy 60 mm. Wlej PBS do innego naczynia o średnicy 60 mm, które posłuży do oczyszczenia trocharu i utrzymania mokrej nerki.
   3. Schłodzić końcówki pipet wyporowych, umieszczając je w otwartych sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml na lodzie. Przechowywać na lodzie z wysuszonymi granulkami komórek i galaretowatą mieszanką białek, taką jak Matrigel.
      nuta: Ważne jest, aby galaretowata mieszanina białek i wszelkie rurki lub końcówki, które będą jej dotykać, były zimne, dopóki igła implantu nie zostanie załadowana.
   4. Znieczulenie myszy: Waż myszy pojedynczo i zapisuj wagę; uderzaj myszy w uszy, aby je ponumerować. Wstrzyknąć im dootrzewnowo 15 μl ketaminy (2,6 mg/ml w soli fizjologicznej)/ksylazyny (100 mg/ml w soli fizjologicznej) na gram masy ciała). Umieść myszy z powrotem w klatce i poczekaj, aż zostaną w pełni znieczulone.
      nuta: Sprawdź poziom znieczulenia myszy, ściskając łapę. Jeśli mysz odruchowo się wzdryga, podaj 25-50% pierwotnej ilości ketaminy/ksylazyny, aby jeszcze bardziej znieczulić mysz. Poczekaj, aż nie wzdrygnie się odruchowo, aby wykonać operację.
   5. Za pomocą maszynki do strzyżenia Oster (golarki) ogol lewą stronę każdej myszy od biodra do ramienia między środkiem pleców a brzuchem. Wstrzyknąć podskórnie 0,3 ml rozcieńczonego karprofenu (6 mg/kg) w ramię lub trójkąt pachwinowy zwierzęcia (dół nogi). Za pomocą bawełnianego wacika nałóż małą kroplę sztucznych łez na każde oko i połóż mysz na boku z powrotem w klatce.
      nuta: Ogranicz przygotowanie do operacji do jednej klatki (około 4-5 myszy) na raz.
   6. Przepłucz kaniulę igły do implantu raka (trokaru) o rozmiarze 16 za pomocą PBS. Za pomocą pary zakrzywionych kleszczy umieść kawałek grasicy z szalki 60 mm w otworze kaniuli z trokarem tuż wewnątrz otworu, a następnie pociągnij trokar, aby zassać tkankę do kaniuli.
   7. Za pomocą pipety wyporowej i schłodzonej końcówki wsypać 5 μl zimnej, galaretowatej mieszaniny białek do probówki z wysuszonymi osadkami komórek (mieszanina CD34+ i CD34- dla wszczepionych komórek) i delikatnie wymieszać, aby wytworzyć zawiesinę komórek. Nie pipetować w górę i w dół. Odpipetować galaretowatą mieszaninę białek / zawiesinę komórek do otworu kaniuli i powoli pociągnąć za trokar, aby załadować igłę.
      nuta: Zaleca się, aby osoba pomocnicza ładowała pipetę podczas manipulowania igłą implantu.
   8. Przetrzyj ogolony obszar myszy jodonem powidonu, a następnie trzykrotnie przetrzyj obszar wacikiem nasączonym alkoholem. Określ najciemniejsze miejsce pod skórą. Wskazuje to na lokalizację śledziony. Nerka znajduje się około 5 mm grzbietowo do śledziony. Podnieś skórę zakrzywionymi kleszczami i wykonaj nacięcie nożyczkami chirurgicznymi o długości 15 mm w skórze równolegle do śledziony. Następnie wykonaj podobne nacięcie w warstwie otrzewnej poniżej. U mężczyzn nerka powinna być dobrze widoczna i może być wytłoczona po prostu przez naciśnięcie na brzuch. Możesz podeprzeć nerkę hemostatem lub zakrzywionymi kleszczami. U kobiet jajniki mają tendencję do blokowania nerki przed łatwym usunięciem. Za pomocą hemostatu podnieś jajnik i ostrożnie odsłoń nerkę.
   9. Użyj kleszczyków zakończonych igłą, aby wyrwać mały otwór na tylnym końcu torebki nerkowej.
      nuta: Nie używaj tych kleszczy z końcówkami igłowymi do pracy z materiałami stanowiącymi zagrożenie biologiczne.
   10. Wsuń igłę implantu do tego otworu i wzdłuż nerki, aż otwór kaniuli zostanie całkowicie zakryty przez torebkę nerkową.
   11. Delikatnie wyciśnij tkankę pod torebkę nerkową i wyciągnij igłę z powrotem. Kawałki grasicy mogą być lepkie, więc użyj zakrzywionych kleszczy, aby upewnić się, że kawałek grasicy nie wyjdzie z igłą.
   12. Podnieś otrzewną kleszczami i delikatnie użyj hemostatu, aby wepchnąć nerkę z powrotem na miejsce. Zawiąż jeden podwójnie zawiązany ścieg w otrzewnej za pomocą wchłanialnych szwów 4-0 vicryl. Użyj dwóch klipsów do nawijania Autoclips, aby zamknąć skórę.
   13. Wymieszaj transdukowane komórki CD34+ odłożone do wstrzyknięcia i pobierz 100 μl (0,5x10⁶ komórek) do strzykawki insulinowej. Wstrzyknij te komórki myszy poprzez wstrzyknięcie do żyły zaoczodołowej lub inne drogi wstrzyknięcia dożylnego. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż małą kroplę sztucznych łez na każde oko i połóż mysz na boku z powrotem w klatce.
   14. Gdy wszystkie myszy zostaną wszczepione, upewnij się, że zwierzęta odzyskują przytomność i normalnie się poruszają, zanim je opuszczą.
   15. Opieka pooperacyjna: Każdą mysz należy wstrzyknąć podskórnie 0,3 ml rozcieńczonego karprofenu (6 mg/kg) i 1,2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej następnego dnia po zabiegu. 2 i 3 dni po operacji wstrzyknąć podskórnie 1,5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do każdej myszy. Monitoruj myszy i nacięcia przez 10-14 dni po zabiegu. Usuń Autoclipy i zważ myszy po 10-14 dniach. nuta: Myszy są ospałe po promieniowaniu, a wstrzyknięcie soli fizjologicznej zapobiega odwodnieniu zwierząt.
   16. Po 8-10 tygodniach sprawdź wszczepienie, wykrwawiając myszy i wykonując analizę FACS krwi obwodowej, barwiąc markery, takie jak CD45, CD3, CD4, CD8 i wszelkie geny, które wektor powinien wyrażać.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw mikrokulek CD34	miltenyi powiedział:	Numer katalogowy: 130-046-702	Do sortowania ludzkich komórek progenitorowych CD34+
Bambanker (Bambanker)	Wako	302-14681	do zamrażania komórek
Zestaw QIAamp Viral RNA	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 52904	Do pomiaru wiremii w surowicy
Cytometr przepływowy MACSQuant	Miltenyi Miltenyi		Do analizy przepływu
BD LSRFortessa™	BD nauki biologiczne		Do analizy przepływu
Hialuronidazy	Sigma	H6254-500MG	Do trawienia tkanek
Deoksyrybonukleaza I	Worthington	LS002006	do trawienia tkanek
Kolagenaza	Technologia życiowa	Numer katalogowy 17104-019	do trawienia tkanek
System detekcji CFX Real Time PCR	Biorad		Do pomiaru wiremii i ekspresji genów
Myszy, szczep NOD. Cg-prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ	Laboratorium Jacksona	5557	Do konstruowania humanizowanych myszy
Penicylina Streptomycyna (paciorkowca pióra)	Thermo Fisher Naukowy	10378016	Do hodowli komórek
piperacylina/tazobaktam	Pfizer	Zosyn	Działa przeciwgrzybiczo
Amfoterycyna B (grzybozon przeciwgrzybiczy)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 15290-018	Działa przeciwgrzybiczo
AUTOCLIP Klipsy do nawijania, 9 mm - 1000 sztuk	Becton Dickinson	427631	Do zabiegu chirurgicznego
Sterylne fartuchy chirurgiczne Aurora wzmocnione poliamidem, 30 sztuk w opakowaniu	Linia medline	DYNJP2707	Do zabiegu chirurgicznego
Szwy, 4-0, vicryl	Owens i Minor	23000J304H	Do zabiegu chirurgicznego
Wkładki nasączone alkoholem	Owens i Minor	3583006818	Do zabiegu chirurgicznego
Rękawice chirurgiczne, 6 1/2	Owens i Minor	4075711102	Do zabiegu chirurgicznego
Pożywka z limfocytów T bez serum firmy Yssel	Produkty Bio-Gemini	400-102	Do transdukcji komórek CD34+
Albumina surowicy ludzkiej	Sigma-Aldrich	A9511	Do transdukcji komórek CD34+

SZT. powiedział: szt. powiedział: